CaMV35S启动子

花椰菜花叶病毒( CaMV )的35S启动子

CaMV35S启动子是指来自花椰菜花叶病毒( CaMV )的35S启动子。这种启动子在植株被CaMV感染期间,指导35S RNA合成,并且使之在许多双子叶植物的组织中高效表达,但它是单子叶植物的一种较弱的启动子。CaMV35S启动子作为一种组成型启动子在所有组织中都能启动基因的表达，具有持续性，不表现时空特异性；RNA和蛋白质表达量也相对恒定。

病毒形态

CaMV, 1937年由Tomkin首次发现,也是第一个发现植物DNA病毒, 其侵染的宿主范围狭窄, 主要限于Cruclferae族。在自然条件下通过蚜虫或叶面摩擦而传染, 实验时也可直接以病毒粗提液或病毒DNA磨擦接种。电镜下观察病毒可见二十面体的颗粒,直径50 nm。中子衍射结果表明, DNA夹子二层外壳蛋白之间, 粒子中空, 中心几乎不含DNA及蛋白质。

结构特点

CaMV完整DNA为双链环状, 包装在病毒颗粒内为松驰环状, ‘ 而在受染植物细胞粒内抽提到的D N A 分子则以超螺旋或微染色体的形式存在。此DNA分子还有个显著特点, 即在双链的三个特定位置存在对核酸酶SI 敏感的不连续区( △ l 一△ 3 ) ,其中α链( - 链) 上有一个, β链( + 链) 二个, 以热或碱处理可得三条单链线性D N A , 一条全长,另二条分别为全长的1 / 3 和2 / 3 ,序列分析表明, 不连续区的5 纽末端重复了同一条链的3’末端, 从而形成了叁键,且有固定的5’末端。

据CaMV完整D N A序列,可推测有八个具转录功能的ORF, 依次呈线状排列,但ORFVIII重叠在ORFV内,且ORFIV与ORFV有较短的交叉。

结构信息

35S启动子起始于CaMV 35S RNA转录起始点-941至+208的BglⅡ 片段,在位于CaMV 35SDN A中的-46至-105区段存在增强子序列,该启动子包括TATA盒、CAAT盒、倒转重复序列和增强子核心序列四个部分。最近发现35S启动子可以划分为两个区域: 从-90 bp至+8 bp为A区域,主要负责在胚根、胚乳及根组织内表达; 区域B(-343至-90 bp)主要控制胚的子叶及成熟植株的叶组织及维管组织内表达。在B区域内的增强子序列可以提高表达水平,如果35S启动子中存在两个B区将能使35S启动子的活性提高10倍,并对异源启动子也有作用,值得注意的是对某些启动子, B区起到一个表达的阻遏因子作用。

改造

在了解CaMV35S 启动子各种顺式作用元件的基础上, 人们利用它的核心序列构建人工启动子, 以得到转录活性更高的启动子。研究者利用CaMV35S 核心启动子与CaMV35S 启动子的5' 端不同区段和烟草花叶病毒的5'非转录区(omega 序列)相连, 发现把两个CaMV35S 启动子-419 ～ -90(E12)序列与omega 序列串联, 在转基因烟草中GUS 有最大的表达活性.把7个CaMV35S 启动子的-290 ～ -90(E7)序列与omega 序列串联, 非常适合驱动外源基因在水稻中表达。用这两种结构驱动GUS 基因表达, 在转基因烟草和水稻中GUS 活性比单用CaMV35S 启动子高20 ～ 70 倍。

应用及前景

对CaMV35S改造, 使之成为有用的植物基因工程载体。基本战略为将病毒DNA克隆入细菌质粒, 并重新感染植物; 通过缺失非必需区增加承载外源基因的能力: 检测外源基因在CaMV宿主中稳定表达的最佳条件, 利用病毒启动子构建嵌合式载体, 这些研究均巳取得了较大的进展。

CaMVDNA克隆入细菌质粒后, 只要质粒DNA部分能以一定的形式去除,且病毒DNA在宿主内完整, 则不论病毒DNA的结构形式如何, 均有不同程度的侵染性。从感染植物中夯禽到的病毒DNA均重新获得环状结构。

CaMV作为植物基因工程载体的第一个成功例子是二氢叶酸还原酶基因取代了病毒的ORFlI而随整个病毒DNA进人宿主并得到表达。但CaMV直接作为载体仍有其局限性,因为CaMV容纳外事基因的空间有限,单纯靠改造,病毒DNA本身来扩大基因容量限制较大,其次, 病毒的寄主范围仅在于十字花科, 对于经济意义较大的单子叶作物似乎无能为力。因此, 人们正在寻求各种途径以克服上述的不足。除了缺失CaMV非必需区外, 还缺失一些较大的功能区, 通过野生型CaMV 的共同感染达到互补,如外源基因取代ORFVI后, 通过共同感染, 已运载成功。

利用CaMV的强启动子(35S promotor)及Poly A信号、Ti质粒片段构建新的载体也是一条有效的途径, 已有许多成功的例子, 35S启动子已使许多基因在植物内得到表达,如使TMV外壳蛋白的基因在转基因植物内得到表达, 得到抗病毒植株; 使荧火虫的发光酶基因进入烟草, 并得到表达。利用35S启动子与pUC8质粒重组后, 用电穿孔法(electroporation)导入玉米原生质体中, 使抗性基因得到表达。

用病毒作载体的优势是操作方便,可在植株水平操作, 感染后的植株不仅整株得到感染,而且还可通过蚜虫或叶面摩擦传染染而扩大到一片植株。另外,病毒拷贝数较高,使外源基因高效表达。因此把病毒与质粒的优点结合起来, 构成高效表达、稳定、可容性大、寄主范围广、操作简单的载体是很有前途的。

检测方法

LAMP 检测方法

植物转基因技术是研究和改良植物遗传资源的强有力工具，其中启动子是基因表达所必需的，决定了外源基因表达的空间、时间和表达的强度等，是人们定向改造生物的重要限制因素。建立转基因产品检测方法，对启动子进行检测是最简单有效的，特别是对于一些未经授权或许可上市，外源基因信息尚未公开的转基因产品的检测筛选，对启动子、终止子的检测甚至是唯一可行的方法。花椰菜花叶病毒CaMV 的35S 启动子是转基因植物中使用频率最高的启动子，能在许多植物物种，几乎所有发育阶段及所有组织中高效表达，被广泛用于构建转基因植株，如玉米、棉花、大豆、番茄等。35S 启动子有很多版本，但其保守序列相当稳定，是转基因检测的最佳靶点。通过检测CaMV 35S 启动子，可筛选产品中是否含有转基因植物成分。

环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification，简称LAMP)技术，是一种体外恒温核酸扩增方法，具有高特异性、高效率和快速灵敏的特点。根据35S启动子的核酸保守序列设计特异性引物，尝试建立快速、简便、灵敏、特异的LAMP 检测方法，以期成为今后转基因产品检测的有效工具。

研究表明，应用所设计的特异性引物，采用LAMP方法检测35S 启动子，灵敏度可达0.002%，远高于欧盟同时也是当前国际上规定的转基因食品和饲料强制标识的最低含量阈值(0.5%)。对大豆、大米、豆粕等植物原材料及其加工产品，LAMP 检测法与现行常用的实时荧光PCR 法的检测结果完全一致。相比之下，该方法对实验条件要求不高，不需要昂贵的仪器，仅使用恒温水浴加热装置即可完成，因此特别适合基层普及使用。

高灵敏度电化学发光PCR方法

电化学发光(electrochemiluminescence, ECL)是指通过电化学方法产生一些特殊的物质, 然后这些电生的物质之间或电生物质与其他物质之间进一步反应产生的一种发光现象。它是化学发光与电化学方法相互结合的产物。大多数转基因植物中使用CaMV35S作为启动子, 因此可通过检测该启动子来判断植物样品中是否含有转基因成分。实验将高灵敏度电化学发光PCR方法用于检测转基因烟草中的CaMV35S启动子, 将该启动子的PCR产物与生物素标记的探针杂交, 可以起到特异性筛选产物的作用;与发光标记物——三联吡啶钌标记的探针杂交, 从而实现电化学发光检测。两种探针同时与待测样品的PCR产物进行杂交, 进一步对样品进行特异性筛选, 从而提高了检测的准确性, 避免了假阳性结果的产生。实验结果表明:该法可以准确的区分待测样品中是否含有35 S启动子, 从而区别转基因烟草和非转基因烟草。电化学发光PCR方法灵敏度高, 可靠性强, 操作简便, 结果准确, 有望成为一种高效的转基因植物检测方法。

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