elispot

固相酶联免疫斑点技术

随着酶联免疫分析技术在医学及生物学领域的广泛应用，使体外检测各种细胞因子及抗体研究有了新的突破。在研究免疫应答机制时以往常用用酶联免疫吸附法（ELISA）检测体液中游离的细胞因子（CK）或抗体，但由于游离的循环抗体或CK的半衰期不同，使之在体液中不断的被代谢或与靶器官结合，而不能确切的反映体内的抗体及CK的水平。80年代，国外的科研工作者根据ELISA技术的基本原理，建立了体外检测特异性抗体分泌细胞和CK分泌细胞的固相酶联免疫斑点技术（ELISPOT）。

主要区别

ELISPOT法源自ELISA，又突破传统ELISA法，是定量ELISA技术的延伸和新的发展。两者都是检测细胞产生的细胞因子或其他可溶性蛋白，它们最大的不同在于：

1、ELISA通过显色反应，在酶标仪上测定吸光度，与标准曲线比较得出定量的可溶性蛋白总量。

2、ELISPOT通过显色反应，在细胞分泌这种可溶性蛋白的相应位置上显现清晰可辨的斑点，可直接在显微镜下人工计数斑点或通过ELISPOT分析系统对斑点进行计数，1个斑点代表1个活性细胞，从而计算出分泌该蛋白或者细胞因子的细胞的频率。（某些研究不仅要测细胞因子生成量，还需检测分泌此细胞因子的细胞频率）

3、由于是单细胞水平检测，ELISPOT比ELISA和有限稀释法等更灵敏，能从 20万-30万细胞中检出 1个分泌该蛋白的细胞。

4、捕获抗体为瑞典高科技生物公司MABTECH, BD、R&D、生产的高亲和力、高特异性、低内毒素单抗，在研究者以刺激剂激活细胞时，不会影响活化细胞分泌细胞因子。

检测原理

细胞受到刺激后局部产生细胞因子，此细胞因子被特异单克隆抗体捕获。细胞分解后，被捕获的细胞因子与生物素标记的二抗结合，其后再与碱性磷酸酶标记的亲和素结合。BCIP/NBT底物孵育后，PVDF孔板出现“紫色”的斑点表明细胞产生了细胞因子，通过ELISPOT酶联斑点分析系统对斑点的分析后得出结果.

应用领域

移植中排斥反应的预测、疫苗发展、Th1/Th2分析、自身免疫病研究、肿瘤研究、过敏性疾病研究、感染性疾病研究、抗原决定簇图谱分析、化合物和药物免疫学反应的筛选等等。

现介绍检测人IFNγ为例的PVDF Eli-spot法，仅供参考。

试剂盒内容：PVDF96孔板，室温保存；0.1ml捕获抗体，4℃保存；0.1ml生物素标记检测抗体，4℃保存；15ul亲和素碱性磷酸酶标，4℃保存；0.25g牛血清白蛋白，4℃保存；0.25g脱脂乳，4℃保存；11ml底物缓冲液，4℃保存；11ml浓缩PBS（10X），室温保存；11ml浓缩洗涤液（200x），室温保存

自备材料/试剂：细胞培养液，CO2孵育箱，70%酒精

直接间接法

可在已包被抗体的孔中直接刺激细胞（直接法），或在24孔板或烧瓶中先刺激细胞，然后放入已包被的孔中（间接法）。使用哪种方法基于：（1）检测细胞的类型；（2）希望得到的细胞量。如果细胞生成只需少量的细胞因子，使用直接法；如果细胞生成细胞因子较多，最好使用间接法。其它步骤一致。

刺激方法：建议用PMA和娄诺霉素刺激PBMC，使其产生IFNγ。

在培养液中稀释PBMC（如：RPMI 1640加2mM谷氨酸盐和10%加热失活的小牛血清），其中含1ng/ml PMA和500ng/ml娄诺霉素（Sigma, Saint Louis, MO）。加5X104至3x105个细胞到抗体包被的PVDF孔，孵育箱中孵育10-15小时。其它的刺激剂孵育时间可能不同，基于细胞因子生成细胞的量，按不同情况作最佳选择。

试剂的准备：1. 10ml磷酸缓冲盐（PBS，10X）以90ml蒸馏水稀释；2. 0.22g脱脂乳用11ml稀释的PBS溶解，最终浓度为2%；3. 0.22gBSA溶解于22ml已稀释的PBS，最终浓度为1%；4. 10ml浓缩洗涤液（200x）以1990ml蒸馏水稀释；5. 10ul亲和素碱性磷酸酶以10ml PBS-1%,BSA稀释6. 7ml酒精以3ml蒸馏水稀释，最终浓度为70%。

操作过程

1. 用50ul 70%酒精孵育PVDF孔板，室温下孵育1分钟。

2. 倒去酒精，用100ul PBS洗涤3次。

3.将100ul捕获抗体加入10ml PBS中，混合，每孔加100ul，盖上板盖，4℃过夜。

4.倒去液体，100ul PBS洗涤一次。

5.每孔加入100ul 2%脱脂乳PBS（见试剂准备），盖上板盖，室温下孵育2小时。

6.在水槽边和吸水纸上轻打，倒去液体。

7.用100ul PBS洗涤一次。

8.每孔加入100ul细胞悬浮液（含适当量的细胞和相应浓度的刺激剂）。细胞可预先在体外接受刺激（间接Eli-spot）。盖上标准的96孔板塑料板盖，37℃ CO2孵育箱中孵育一定的时间（15-20小时）。这期间不要晃动或移动孔板。

9.在水槽边和吸水纸上轻打，倒去液体。

10.每孔加100ul洗涤缓冲液，4℃孵育10分钟。

11.用100ul洗涤缓冲液洗孔3次。

12.于10ml PBS-1%BSA中稀释100ul检测抗体，此为一板的量。每孔加100ul此液体，盖上板盖，室温下孵育2小时。

13.倒去液体，用100ul洗涤缓冲液洗3次。

14.每板以10ml PBS-1%BSA稀释10ul的亲和素碱性磷酸酶。每孔加入100ul此液体，盖上板盖，室温下孵育1小时。

15.倒去液体，用100ul洗涤缓冲液洗3次。在吸水纸上拍打，吸干残留的洗涤液。

16.每孔加入100ul BCIP/NBT。

17.室温下反应5-15分钟。完全显色后，将此液倒于相应的盘中。

18.用蒸馏水充分洗涤膜的两边。吸水纸上轻拍，使膜干燥。保存时，将板倒置以免残留的液体流回膜上一旦膜干燥后，读取点数。4℃下放置一夜，点会比较明显。

此板在室温下避光保存。

使用时应注意BCIP/NBT缓冲液是潜在的致癌物质，试验时带手套，使用后适当处理。对MAIPAN4510板，孵育时由于毛细作用，试剂渗入膜中，此液体难以洗去，因此导致背景增加。为了避免此情况，建议在步骤12时将板底移去，将膜倒转，用蒸馏水流冲洗，同时用洗涤缓冲液按正常的步骤洗涤。在步骤14中，由于板底已移去，建议将MAIP4510板放于空的96孔板上，其后的步骤不变。

预包被

利用预包被工艺将捕获抗体包被于PVDF板上，真空干燥后保存。用时先以细胞培养基活化（100ul/孔），后直接加入待测细胞悬液进行孵育，后续步骤同上。大大减少了实验时间，提高了效率。

刺激剂选用

检测T淋巴细胞功能最常用的方法是用非特异性激活剂(如Con A),植物凝集素 PHA, 佛波醇酯PMA, 娄诺霉素+PMA等；而检测B淋巴细胞功能最常用脂多糖 PS, 美洲商陆PWN,葡萄球菌A-SAC来激活。其中Con A一般适用于小鼠；PHA适用于人，对小鼠有一定效果；娄诺霉素（Ionomycin）+PMA对人鼠皆有效果，且适用于IFNγ和IL-4等多种细胞因子。

关于实验步骤

1. 封闭步骤可用FBS、BSA、酪蛋白等代替脱脂乳，效果会更好，但价格较高，。

2. 孵育后细胞裂解可使用低盐溶液或去离子水，4℃孵育10分钟，低渗裂解细胞。

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