TILLING技术

反向遗传学研究方法

TILLING，即Targeting Induced Local Lesions In Genomes（定向诱导基因组局部突变技术），是由美国FredHutchinson癌症研究中心StevenHenikoff领导的研究小组发展起来的，是一种全新的反向遗传学研究方法。TILLING技术借助高通量的检测手段，快速有效地从由化学诱变剂（EMS）诱变过的突变群体中鉴定出点突变。TILLING已被应用于多种生物的研究中。

主要流程

以植物为例，Tilling技术主要流程如下：

1：甲基磺酸乙酯（EMS）诱变种子，诱导产生一系列点突变；

2：将种子培养，获得第一代突变个体（M1）；

3：M1植株自交，产生第二代植株（M2）；

4：按单株抽提M2植株的DNA，存放于96孔微量滴定板，并保留M2代种子；

5：将多个96孔板的DNA样本合并到一个96孔板内（最多可合并8个，每块板相当于768个M2单株）构建DNA池；

6：根据目标基因序列设计一对特异性引物进行PCR扩增，两个引物分别用700nm和800nm荧光染料标记；

7：PCR扩增片段变性、退火，从而得到野生型和突变型所形成的异源双链核酸分子；

8：用特异性识别并切割错配碱基的核酸内切酶CELI酶剪切异源双链核酸分子；

9：酶切产物用变性的聚丙烯酰胺（DPAGE）凝胶电泳分离，然后用标准的图象处理程序分析电泳图象，获得突变池；

10：利用相同方法从突变池中筛选突变个体；

11：突变个体PCR片段测序验证；

12：突变表型鉴定。

技术特点

A、技术相对简单

由于TILLING技术是传统的化学诱变技术与双色红外荧光检测技术的有机相结合，不需要复杂的技术和设备就可以对突变体库进行大规模筛选，是一种高通量并且相对廉价的技术，提高了筛选效率。

B、可以预测突变频率，获得满意的突变密度使用群体较小

TILLING技术可以预先估计突变的概率，指导突变体库的构建。化学诱变技术的突变频率可以预先估算出来，如EMS主要诱导碱基从C到T的改变，有实验证实，发生C/G到T/A的转变有99%的概率。对这一频率的计算对于确定目标基因的最佳扩增片段有重要的指导意义。于不同物种、不同受体的诱变频率有很大差异，对突变频率的合理估算将增加TILLING的效率。据现有的拟南芥ATP项目的粗略计算，每1Mb约含有4个突变，即每250kb左右含有1个突变，以这一突变密度估算，获得满意的突变密度所需的突变体群体大小小于10000个植株。

C、高通量、自动化操作可以快速获得鉴定结果

TILLING技术集成了自动加样设备、高通量的电泳检测设备，以及优秀的图象处理和分析系统，容易的实现了自动化操作。拟南芥中TILLING技术己能够完全自动化。对于有着高突变频率的群体（如ATP项目中，每个基因组中含有约1000个突变，即突变频率约为每1Mb含有7个突变），一天就可以筛选出20个突变，至少可以获得一个被敲除的基因突变和超过12个以上的一系列错义突变。如果用标准的自动加样器结合自动化手臂的操作替代手工操作，有望把筛选量增加到每天16轮，这样每天就可以鉴定3到4个基因。由此可见，TILLING技术适应了大规模高通量的筛选要求。

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