乳过氧化物酶

存在于乳汁中的血红素蛋白

乳过氧化物酶(Lactoperoxidase，EC 1.11.1.7，简称LP)是存在于乳汁中的一种血红素蛋白，是一种来自动物的过氧化物酶，在初乳中含量尤其丰富。乳过氧化物酶和过氧化氢以及硫氰酸根(SCN)可以形成“乳过氧化物酶体系(LPS)”。这个酶系统具有抑菌活性，可以在没有冷藏的条件下，抑制革兰氏阳性菌和阴性菌的生长，延长鲜乳的保质期，具有“冷杀菌”的作用。乳中的LPS不仅具有抗菌作用，还可预防过氧化氢等过氧化物的积累，从而避免了过氧化物引起的细胞损伤，起到保护乳腺的作用。

存在部位

LP是过氧化物酶家族的成员之一,是存在于乳汁中的一种血红素蛋白，是人乳和牛乳中非常常见的成份之一,在哺乳动物的乳腺、唾液腺、泪腺及其分泌物中都能找到。

结构

LP是由一条多肤链构成的,包括612个氨基酸残基,分子量大约是78kD,等电点为9.6,是一种碱性蛋白,也是一种糖蛋白。它含有一个血红素和大约10%的碳水化合物,其催化活性中心的血红素是一个原叶琳ix,通过一个酷键共价连接到多肤链上构成的。LP中铁含量是0.07%,铁是血红素的一部分,每个LP分子对应一个铁。研究发现,LP结构中二硫键的破坏和亚铁血红素的存在与否直接影响LP的活性和稳定性。

浓度及活性

在牛乳中,LP是仅次于黄嚓吟氧化酶第二丰富的酶,它在乳中的浓度大约是30mg/L。有报道,LP含量的改变与牛的生殖周期、季节、品种和喂养制度有关,需要注意,不像其它抗菌蛋白,LP的含量在牛初乳中是较低的,但在产后3~5天LP含量迅速增加以达到最大值。不同来源乳中的LP的活性不同，可以看到牛乳中LP的平均活性为2.3 U/mL;人乳中LP的活性较低,为0.67一0.97u/mL;豚鼠的LP具有最高的活性,达到22 u/mL。据报道,LP的酶活力必须达到0.02 U/mL以上才具有抑菌活性。

理化性质

存在于乳腺、泪腺、唾液腺中的LP在化学上和免疫学上的性质都是类似的。LP参与抑制微生物生长首先被Hanssen提出,他指出LP参与构成宿主对抗入侵微生物的天然防御系统。除此之外,LP还具有抗菌活性、降解各种致癌物质以及保护动物细胞被过氧化的能力。LP是乳中热稳定性的酶之一,它的破坏已经被作为巴氏灭菌效力的指标之一。Mark证实了常规的巴氏灭菌不能让乳中的LP失活,但是,LP在酸性条件下(pH5.3)的热稳定性会降低,可能是由于钙从分子中释放出来,看来钙离子浓度对LP的热稳定性有较大影响。LP对许多蛋白质水解酶都是相对稳定的,但是,在核黄素存在下LP对光特别敏感。

乳过氧化物酶体系（LPS）

组成成分

所谓LPS必须同时包括3种组成成分,即乳过氧化物酶,硫氰酸盐和过氧化氢。只有这三种成分共同作用才具有抗菌活性。在实际应用中,若体系中的某一组分浓度不够时,则需要添加外源或设法生成,以保证抗菌效果,这就是LPS的“激活”。其中,乳过氧化物酶的浓度不低于0.02 U/mL。牛乳中天然的LP的浓度为1.4U/mLL,水牛乳中为0.9 U/mL可满足这一要求。因此,无须添加外源,而硫氰酸盐广泛存在于动物的组织和分泌液中,乳中的硫氰酸盐来自血液,浓度仅为3-5 μg/mL,成为限制因素。据报道,激活LPS所需的硫氰酸盐的浓度约为15μg/mL或以上,所以要激发LPS需要添加外源。在刚挤出的牛乳中过氧化氢含量仅为1-2μg/mL,而激活需8-10μg/mL的过氧化氢,必须外源供给过氧化氢。

抑菌效果

LPS的抗菌性是表现在对乳中一些微生物具有抑菌或杀菌作用其抗菌机理是微生物细胞质膜上的琉基基团被氧化,导致细胞质膜结构破坏,钾离子、氨基酸和多肤泄露,使细胞对葡萄糖、氨基酸、漂吟、嚓陡的摄取以及蛋白质、DNA和RNA的合成受到了抑制口l。抗菌因素与供电体、介质、温度、PH值的不同以及从氧化物的脱氧到糖酵解途径的堵塞或干涉细胞病变等有关。

不同的细菌对LPS的敏感程度不同。革兰氏阴性,过氧化物酶阳性细菌,如假单胞菌属,大肠杆菌,沙门氏菌属不仅能被抑制,在PH、温度、培养时间和接种量不同时,还能被杀死。革兰氏阴性菌如链球菌属和乳酸菌往往只能被抑制。细菌受LPS影响程度的不同可能与细菌的细胞膜结构和特性不同有关。革兰氏阴性菌的细胞膜比革兰氏阳性菌的细胞膜更容易被LPS破坏。致使一些营养成份泄漏,妨碍了细菌自身对营养的摄取,最终导致细菌的死亡或衰退。

从山羊乳中纯化出的LPO在硫氰酸盐和过氧化氢的媒介中表现出强的抗真菌能力。山羊乳中的LPS可以抑制黄曲霉、木霉属的生长繁殖。山羊乳中的LPS还能抑制曲霉属、交链包霉属、产黄青霉和麦角属。

乳过氧化物酶的检测

鉴于其重要的应用价值，因此测定LP 活性尤为重要。目前，国内外有关LP 检测方法的研究较多，大多是基于颜色反应，利用酶促反应原理，借助分光光度计测定酶活大小。

苯胺类检测LP 活性

以苯胺类为底物测定过氧化物酶活性，其原理为在过氧化物酶存在时，H2O2 可使苯胺发生氧化聚合反应，产物为棕褐色物质。该物质于415 nm 波长下有最大光吸收，因此利用分光光度法测定反应液的吸光度，以吸光度的变化速率来表征过氧化物酶活力。

愈创木酚法检测乳过氧化物酶

愈创木酚检测方法的原理，在LP 催化作用下，过氧化氢氧化愈创木酚，产物为醌类化合物，此化合物可进一步缩合或与其他分子缩合，生成红棕色的4 -邻甲氧基苯酚。利用愈创木酚检测方法测定LP 时要求严格控制时间，检测过程中用酸终止酶促反应，导致试验结果明显偏低。

ABTS 法检测乳过氧化物酶

ABTS 主要用来测量和表征抗氧化剂抗氧化能力，是近些年兴起的一种相对简便的用于体外测定物质总抗氧化能力的方法。最初由Marklund 提出，用含有蛋白质的血红素过氧化物酶与ABTS 反应生成ABTS+，用于测定样品中血红蛋白的含量，目前已广泛应用于包括血清类的生物样品、果蔬类和一些纯物质抗氧化能力的测定。利用ABTS 法检测LP的原理如下：在LP的催化作用下，过氧化氢可将无色的还原型ABTS 氧化，生成的氧化型ABTS 为绿色物质，该绿色物质于416 nm 波长附近有最大光吸收。根据颜色的深浅，借助于可见分光光度计，测定反应的吸光度，进而换算待测样的酶活或酶浓度。

TMB 法检测乳过氧化物酶

TMB 因其安全性和较高的敏感性，正逐步取代有致癌性的ABTS 显色剂用于LP 的检测中。TMB检测法的原理是在过氧化物酶存在条件下，TMB 能被过氧化氢氧化生成明亮的蓝色物质，已知该有色物质于波长655 nm 下有最大吸收峰。根据颜色的深浅，借助分光光度计，测定反应的吸光度，进而换算待测样的酶活或酶浓度。

免疫学方法

酶联免疫吸附试验（ELISA）即将抗原或抗体吸附在固相载体表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行的技术。ELISA 方法是近30 年来发展起来的综合性酶免疫化学分析方法，采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，用于定量测定抗原或者抗体。使用该测定方法有3 种必要的试剂：固相的抗原或抗体（免疫吸附剂）、酶标记的抗原或抗体（标记物）、酶作用的底物（显色剂）。

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