分子原位杂交

杂交方式

分子原位杂交：利用一段顺序的单链DNA或RNA作探针，与解链的染色体上的DNA单链进行原位杂交，确定DNA或RNA所在位置。

引言

核酸原位杂交技术就是利用放射性或非放射性标记的已知核酸探针，通过放射自显影或非放射检测系统在组织、细胞及染色体上检测特异DNA或RNA序列的一种技术，是一种直接、简便的研究基因定位和表达的方法。原位杂交的杂交双方是待测核酸序列及探针，待测核酸序列可以是克隆的基因片段，也可以是未克隆化的基因组DNA和细胞总RNA。核酸探针是指用放射性同位素、非放射性荧光染料直接或间接标记的，能与特定的核酸序列发生特异性互补的已知DNA或RNA片段。根据其来源和性质可分为cDNA探针、基因组DNA探针、寡核苷酸探针、RNA探针等。原位杂交的基本原理：当溶液中的DNA分子经高温或高PH处理后，DNA双链分子会变性产生两条单链，如果将温度逐渐下降或PH恢复到中性，单链会按照碱基互补配对的原则，重新形成氢键恢复到原来的双链结构。如果两条单链的来源不同，只要它们之间的碱基顺序同源互补或者部分同源互补，在条件适宜时，就可以全部或部分复性，产生分子杂交。原位杂交技术包括有：菌落原位杂交（colony in situ hybridization）、斑点杂交法（Dot blot）、Southern印迹杂交（Southern blot）、Northern印迹杂交（Northern blot）、组织原位杂交（Tissue in situ hybridization）和基因组原位杂交（Genome in situ hybridization） v原位杂交组织化学技术在生命科学的研究中可视为一项革命性的技术。它使它们的研究从器官、组织和细胞水平走向分子水平。为各个学科的研究带来突破性的进展。其中特别突出的是细胞或组织的基因表达、染色体分析、病毒诊断和发育生物学。原位杂交技术主要步骤：材料处理及细胞样品的固定；样品的制备和预处理；探针的制备和预杂交；探针及样品的变性；杂交温育；检测杂交信号，进行结果分析。

分子杂交作图法

片段间重叠的信息来自于每个片段所含内容的部分信息。在解释什么是部分信息之前，必须强调的是，在这里我们称片段为克隆(clone)。在用不同的方式将每份目标DNA分子打碎并将片段克隆之后，我们就得到了几千个克隆构成的集合，称做克隆库(clone library)。

每个克隆的部分信息是通过杂交实验（hybridization experiment）来获得的。在这些实验里，我们检测被称为探针(probe)的小序列可否与克隆结合或杂交，如果发生了结合，就说明该克隆包含与该探针序列互补的序列。对于同一个克隆，我们对采用不同的探针重复杂交实验，与该克隆杂交的所有探针的集合称为该克隆的指纹。指纹重叠的两个克隆可能来自目标叫A分子的交叠区域。例如，如果我们知道了探针人x、y、z可能与克隆A结合，而探针x、w、和z能与克降B结合，我们就很有理由相信克隆A和B互相交叠，如图1所示(除非存在重复片段)。注意，这类信息一般并不能足以使我们确定这些探针在目标DNA中的位置，而仅能确定它们的相对顺序。

在杂交实验中各种错误都可能发生。首先，探针可能结合失败，这就产生了假阴性(False negative)的结果；其次，探针也可能结合到了不该结合的位置上，产生假阳性(false positive)结果；有时还会出现人为对实验结果的判读错误，这也可能产生假阳性或假阴性结果。有时，甚至在杂交尚未发生前错误就已出现。在克隆过程中，DNA分子的两个片段可能会发生融合并像单一克隆那样进行复制，这种克隆称之为嵌合克隆(chimeric clone)．它可使人们产生关于探针相对顺序的错误推断；嵌合现象常有发生，故其已成为杂交作图中的一个严重问题。有估计认为在许多克隆库中有高达40%一60%的克隆实际上是嵌合体。克隆过程中的另一类错误是缺失(deletion)，即克隆丢失了一个内部片段，因而使目标DNA分子中两个本不相邻的片段连接在一起.

另外还有两种情况也可使杂交标图过程出现问题。第一是探针不唯一，这意味着探针可与目标DNA分子一个以上的位点结合，这些位点序列称为重复序列(repeat)。一种称做序列标记位点(sequence tagged site, sts)的技术可避免这个问题，它产生的探针可与目标DNA分子上专一的位点进行杂交。第二个问题是数据缺乏，因为在杂交实验中完成所有的杂交不太可行。分享技术(pooling technique)是解决此类问题的措施。

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