单细胞凝胶电泳技术

1984年创立的单细胞凝胶电泳技术

单细胞凝胶电泳分析(singlecellgeleletrophoresis,SCGE)是Ostling等(1984)首创的,以后经Singh等(1988)进一步完善而逐渐发展起来的一种快速检测单细胞DNA损伤的实验方法,因其细胞电泳形状颇似彗星,又称彗星试验(cometassay)。

原理

该技术的原理是基于有核细胞的DNA分子量很大，在DNA超螺旋结构附着在核基质中，用琼脂糖凝胶将细胞包埋在载玻片上，在细胞裂解液作用下，细胞膜、核膜及其他生物膜破坏，使细胞内的RNA、蛋白质及其他成分进入凝胶，继而扩散到裂解液中，惟独核DNA仍保持缠绕的环区附着在剩余的核骨架上，并留在原位。如果细胞未受损伤，电泳中核DNA因其分子量大而停留在核基质中，经荧光染色后呈现圆形的荧光团，无拖尾现象。若细胞受损，在碱性电泳液（pH>13）中，先是DNA双链解螺旋且碱变性为单链，单链断裂的碎片分子量小即可进入凝胶中，在电泳时断链或碎片离开DNA向阳极迁移，形成拖尾。细胞核DNA损伤愈重，产生的断链或碱易变性片段就愈多，其断链或短片也就愈小，在电场作用下迁移的DNA量多，迁移的距离长，表现为尾长增加和尾部荧光强度增强。因此，通过测定DNA迁移部分的光密度或迁移长度就可定量测定单个细胞DNA损伤程度。

优点

该方法灵敏、简便、快速、低耗、重复性好，已被广泛应用于体内或者体外各种有核细胞经受试物诱导的DNA损伤和修复的研究。

实验举例

Kizilian(1999)改进了一些试验条件,能明显将细胞调亡和细胞坏死的形象与“彗星”区分。MarkS.Rundell等(2003)报道彗星试验测行的损伤主要是由致突变剂引起的。RichardD.Bowden等(2003)研究出了一种新的分析试验结果的彗星尾图谱,可以更加准确的分析彗星的长度及密度。SCGE是评价遗传毒性损害非常敏感的实验,可以检测到每1.657×10-37kg中0.1个DNA的断裂。与经典的染色体畸变、微核、SCE相比,SCGE可以用于活细胞DNA的检测,也能用于死亡细胞DNA的分析,使SCGE不仅可以研究低剂量下的生物效应,也可用于研究高剂量下的生物效应;同时SCGE又可提供DNA修复能力的信息,这使得SCGE非常适用于评价受试物的遗传毒性剂及材料:

1）PBS

2）0.8%正常熔点凝胶（PBS配制）

3）0.6%低熔点凝胶（PBS配制）

4）毛玻璃片

5）盖玻片

6）碱性裂解液（2.5mol/L NaCl;100mmol/L Na2EDTA;10mmol/L Tris;1%肌氨酸钠），临用前加10%DMSO，1%Triton X-100

7）电泳缓冲液（1mmol/L Na2EDTA;300mmol/L NaOH；Tris-HCl，pH7.5）

8）EB（2ug/ml）

步骤

1.制备第一层胶：100ml 0.8%正常熔点胶，加盖盖玻片，4℃固化10min；

2.制备第二层胶：轻轻地去除盖玻片，在第一层胶上滴加75ul含1×10000个细胞的0.6%低熔点胶（cell与凝胶比例为1：5），加盖盖玻片，4℃固化10min；

3.裂解：去掉盖玻片，将凝胶浸入冰冷的碱性裂解液内（临用前加10% DMSO(二甲基亚砜))，1%Triton X-100），4℃裂解1h；