外源基因导入

通过现代遗传工程技术将来自于不同生物体的基因导入受体生物基因组的过程

外源基因导入（introduction of foreign gene）是指通过现代遗传工程技术将来自于不同生物体的基因导入受体生物基因组的过程。

简介

外源基因导入是基因工程的一个关键步骤。外源基因导入需要合适的载体、酶、和方法。

外源基因导入的方法很多，但同一个方法不能适用于所有的生物体。

外源基因导入是基因工程或转基因工程的一个关键步骤。是指通过现代遗传工程技术将来自于不同生物体的基因导入受体生物基因组的过程。

外源基因导入是增加生物体遗传多样性、创造新品种和新性状的重要途径和方法。外源基因导入也是研究基因功能必不可少的技术手段。

过程

外源基因的获得

真核细胞基因主要通过人工合成获得：一是以mRNA为模板，逆转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需要的基因；二是以已知蛋白质的氨基酸序列推测出相应的 mRNA序列和结构基因的核苷酸序列，再通过化学方法以单核苷酸为原料合成。

克隆到载体

常用的载体是质粒。利用同样限制性内切酶切断外源基因和质粒，并在DNA连接酶作用下，将质粒与外源基因结合形成一个重组DNA分子。

转化和表达

通过载体把外源基因带入生物体内，并使它得到表达。常用的受体细胞有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、动植物细胞等。外源基因导入受体细胞后，就可以随着受体细胞的繁殖而复制。

筛选和检测

在全部受体细胞中，真正能够摄入外源基因的受体细胞是很少的。因此，必须通过一定的手段对细胞中是否导入了外源基因进行检测。检测的方法有很多种，比如抗性筛选。

方法

外源基因导入宿主细胞的方法很多。在植物和微生物生物技术中，外源基因导入到寄主细胞的过程也称为转化；在动物生物技术中，该过程被称为转染。

对于某些细菌，不需要外部方法来引入基因，因为它们天然能够吸收外源DNA。大多数物种的细胞对外源基因是有阻隔作用的，因此，需要某种干预增加细胞膜通透性，允许DNA通过，并允许DNA稳定地插入宿主基因组中。

化学方法

基于化学的外源基因导入方法依赖于使用天然或合成的化合物形成促进基因导入的颗粒。这些物质能够静电结合到DNA或RNA并将它们进行压缩，所以可适应较大的外源基因的导入。化学载体通常通过内吞作用进入细胞，可以保护外源基因免于降解。

热激

最简单的导入方法之一是给细胞一个热冲击来改变细胞环境。热激前，将细胞保存在冷的含有二价阳离子（通常为氯化钙）的溶液中温育。氯化钙能部分破坏细胞膜，使外源DNA进入宿主细胞。

磷酸钙

另一种简单的方法涉及使用磷酸钙来结合DNA，然后将其暴露于培养细胞。溶液与DNA一起被细胞包围，少量的DNA可以整合到基因组中。

脂质体和聚合物

脂质体和聚合物可用作载体将DNA导入到细胞中。带正电荷的脂质体与带负电荷的DNA结合，而聚合物可以设计成与DNA相互作用。它们分别形成脂质复合物和复合物，然后被细胞摄取。

纳米粒子

使用工程改造过的无机和有机纳米粒子是一种非病毒的实现外源基因导入的方法。

物理方法

物理方法就是通过外力将遗传物质引入导入细胞的方法。

电穿孔

用10-20kV / cm的电场短暂地冲击细胞，在细胞膜上产生小孔，质粒DNA可以通过该孔进入。电击后，小孔通过细胞的膜修复机制迅速关闭。

基因枪

使用生物射弹将DNA插入植物细胞的另一种转化方法。其中金或钨的颗粒被DNA包覆，然后射入幼苗或植物胚胎。该方法可用于对土壤杆菌感染不敏感的植物，也可以用于植物质体的转化。植物细胞也可以使用电穿孔进行转化。由于对细胞和DNA造成的损害，生物射弹和电穿孔的转化效率低于农杆菌转化。

显微注射

将DNA通过细胞核包膜直接注入细胞核的地方。这是动物转基因应用较多的技术。

声穿孔

使用声波在细胞膜中产生孔隙以允许遗传物质进入。

光穿孔

用激光脉冲在细胞膜中产生孔以允许遗传物质进入。

磁转

磁转使用与DNA复合的磁性颗粒和外部磁场浓缩核酸颗粒进入靶细胞。

农杆菌转化

利用农杆菌T-DNA序列，允许遗传物质自然插入植物细胞。质粒T-DNA随机整合到宿主细胞的基因组中。通过修改质粒以表达目的基因，可以将选择的目的基因稳定地插入植物基因组中。 T-DNA唯一重要的部分是它的两个小的（25个碱基对）边界重复序列，其中至少有一个是植物转化所必需的。另一种方法是农杆菌渗入。

病毒转化

病毒介导的外源基因导入是利用病毒将其DNA注入宿主细胞内的能力以及病毒自身复制能力将外源基因导入的方法。病毒转化方法更易诱导免疫反应，但具有高效率。然而，病毒只能将非常小的DNA片段输送到细胞中，费力、插入位点随机，存在细胞质效应和诱变的风险。

应用

基因治疗

基因疗法利用外源基因导入来治疗细胞疾病或病症，利用能够产生细胞特异性的非免疫原性载体提供足够量的转基因表达以产生所需效果。

培育转基因动植物新品种

外源基因导入应用最广泛的领域是转基因生物新品种的培育。以转基因植物为例，2016年，全球范围转基因栽培面积达到1.9亿公顷。

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