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对流免疫电泳

对流免疫电泳

对流免疫电泳是免疫电泳技术中的一种，还包括免疫电泳、火箭电泳等方法。

原理
在pH值8.6的琼脂凝胶中，抗体球蛋白只带有微弱的负电荷，而且它分子又较大，所以泳动慢，受电渗作用的影响也大，往往不能抵抗电渗作用，故在电泳时，反而向负极倒退。而一般抗原蛋白质常带较强的负电荷，分子又较小，所以泳动快，虽然由于电渗作用泳动速度减慢，但仍能向正极泳动。如将抗原置阴极，抗体置阳极，电泳时，两种成分相对泳动，一定时间后抗原和抗体将在两孔之间相遇，并在比例适当的地方形成肉眼可见的沉淀线。这样由于电泳的作用，不仅帮助抗体定向移动，因而加速了反应的出现，而且也限制了琼脂扩散时，抗原抗体向四周自由扩散的倾向，因而也提高了敏感性，本法比琼脂扩散法的灵敏度要高10～16倍，而且反应时间短，可用于各种蛋白的定性和半定量测定。
操作方法
1．制琼脂板 以pH8.6离子强度0.05巴比妥缓冲液配成1%～1.5%琼脂凝胶板，厚度2mm～3mm。
2．打孔 琼脂冷却后，按图打孔，打成对的小孔数列，孔径0.3cm～0.6cm，孔距0.4cm～1.0cm。挑去孔内琼脂，封底。
3．加样 一对孔中，一孔加已知（或待测）抗原，另一孔加待测（或已知）抗体。
4．电泳 将抗原孔置于负极端。电压2.5V/cm～6V/cm，或电流强度3mA/cm～5mA/cm，电泳时间30min～90min。
观察结果
断电后，将玻板置于灯光下，衬以黑色背景观察。阳性者则在抗原抗体孔之间形成一条清楚致密的白色沉淀线。如沉淀线不清晰，可把琼脂板放在湿盒中37℃数小时或置电泳槽过夜再观察。
注意事项
1．抗原抗体浓度的比例 当抗原抗体比例不适合时，均不能出现明显可见的沉淀线。所以除了应用高效价的血清外，每份待测样品均可做几个不同的稀释度来进行检查。
2．特异性对照鉴定 为了排除假阳性反应，则在待检抗原孔的邻近并列一阳性抗原孔，若待检样品中的抗原与抗体所形成的沉淀线和阳性抗原抗体沉淀线完全融合时，则待检样品中所含的抗原为特异性抗原。
3．适当的电渗作用在对流免疫电泳中是必要的。当琼脂质量差时，电渗作用太大，而使血清中的其它蛋白成分也泳向负极，造成非特异性反应。在某些情况，琼脂糖由于缺乏电渗作用而不能用于对流免疫电泳。
4．当抗原抗体在同一介质中带同样电荷或迁徙相近时，则电泳时两者向着一个方向泳动。故不能用对流免疫电泳来检查。
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