放射免疫分析法

医学术语

利用同位素标记的与未标记的抗原同抗体发生竞争性抑制反应的放射性同位素体外微量分析方法。又称竞争性饱和分析法。

简介

1960年美国化学家R.S.耶洛和S.A.贝尔森提出此法，耶洛因此于1977年获得诺贝尔生理学或医学奖。

她从小酷爱自然科学。在大学里，她热衷于物理学，却致力於医学研究，她工作於纽约市布隆克斯区退伍军人医院，致力于「胜太荷尔蒙的放射免疫分析」。居里夫人自传和核子物理学家美籍意大利人费米的讲演，对她后来的事业产生了很大的影响。她渴望从事科学研究工作。然而，当时的美国，哪个大学也不同意将一笔物理学奖金给一个女人。她主动给一位杰出的化学家当非全日制秘书。由于工作出色，几个月后，伊利诺依大学给了她一份奖学金，并给了她一个助理研究员的位置。从1941年到1945年，她把主要精力都用在三项活动上：教学、钻研高深课题和准备核物理博士论文。她于1945年获得博士学位。从1945年起，她边授课，边研究，边著书立说，并在勃隆克斯医院筹备和开发新的放射性同位素应用工作。

早在得奖的二十多年前，耶洛便在一个偶然的机会里，发现猪胰脏的胰岛素可用来治疗糖尿病，可以使病人产生抗体。这种发现与当时的治疗理论不太合适。因为治疗药物能引起抗体是不可思议的事，因此其发现并不为当时的人所接受。然而，这个发现却引导近代内分泌学的研究进入了新的境界，更由此而推展，使得已往不易测定的身体中的物质得以测定。这个方法就是放射免疫测定法，又叫放射免疫测定法（radioimmunoassav，简称RIA）。80年代初，应用此法测定的生物活性物质已达300种以上。

原理

使放射性标记抗原和未标记抗原（待测物）与不足量的特异性抗体竞争性地结合，反应后分离并测量放射性而求得未标记抗原的量。用反应式表示为：

*Ag为同位素标记的抗原,与未标记的抗原Ag有相同的免疫活性，两者以竞争性的方式与抗体Ab结合，形成*Ag-Ab或Ag-Ab复合物,在一定反应时间后达到动态平衡。

如果反应系统内加入的*Ag和Ab的量是恒定的,且*Ag和Ag的总和大于Ab有效结合点时,则*Ag-Ab生成量受Ag量的限制。Ag增多时，Ag-Ab生成量也增多，而*Ag-Ab生成量则相对地减少,同时游离*Ag也增多。因此,*Ag-Ab与Ag的含量呈一定的函数关系。

如采用一种有效的分离方法，将*Ag-Ab和Ag-Ab复合物 (以 B表示)与*Ag、Ag(以F表示)分离,并测定B和F的放射性,可有以下规律:如样品中Ag增多，则F的放射性降低，即Ag与F成反比。计算B/F或B/T值 (T=B+F),即可算出样品中Ag的含量。由于 RIA是以放射性标记与非标记抗原竞争性地与抗体结合为理论基础，故又称为竞争性放射饱和分析法。

测定方法

分别在一定数量的试管中加入不同浓度的标准抗原（或未知样品），每管加入等量的放射性标记抗原和一定量的抗体，在4℃或37℃下保温,待反应平衡后,选用适当的方法将B和F分离，测量放射性强度,由放射性强度比B/T对Ag量制出标准曲线,即可从标准曲线上查出未知样品量。

测定时，首先要制备出纯的抗原和抗体。凡能刺激机体产生抗体，且与抗体发生特异性结合反应的物质通称为抗原，例如蛋白质(细菌、病毒、异种血清等)。只有反应原性而无免疫原性的物质称为不完全抗原或半抗原，如多糖、类脂和一些小分子物质。可用化学方法把一些半抗原与载体（蛋白质的大分子）结合而获得免疫原性,这种结合为RIA 开辟了广泛的应用范围。常用的载体有γ球蛋白、纤维蛋白质、鸡卵蛋白、血蓝蛋白和各种甲状腺球蛋白。半抗原结合载体是由半抗原的功能基团与载体功能基团所决定，一般连接后不应引起半抗原结构改变，也不使载体蛋白变性。常用结合载体的方法有混合酸碱法、水溶性的羰二亚胺法等。

抗体是能与相应抗原或半抗原专一地结合的免疫球蛋白分子。应用免疫技术可以获得特异性的抗体。抗体的敏感度范围由其特异性和亲和力决定，测定时所用的抗体稀释度越低，则加入的量越多，测定的敏感度越低，可测范围越宽。如加入抗体量少，则测定的敏感度提高，可测范围变窄。一般在选定标记抗原用量后，即可根据测定要求来选择合适的抗血清用量。

常用于标记抗原的放射性同位素有3H、125I、131I 等，3H可以置换有机化合物中的氢，且不影响原有化学性质。3H半衰期长，能量低，便于防护，常用的标记化合物有3H环磷酸鸟苷、3H环磷酸腺苷、3H睾丸酮等。125I 和131I原子的化学性质比较活泼,标记方法简便,不论多肽、蛋白质或小分子半抗原均可进行碘标记。有些半抗原不能直接用碘标记, 常常接上一个酪氨酸再以碘标记,以减少标记抗原免疫化学活性的损失。常用的偶联试剂有：碳化二亚胺类、异?唑盐类、烷基氯甲酸酯类、二异氰酸盐类及亚氨酸酯等。

应用

此法用于在内分泌学中测定胰岛素、生长激素、甲状旁腺激素、血管紧张素、催乳素、黄体化激素、促卵泡成熟激素、前列腺素等，以鉴别、诊断、研究激素的生理和药理作用，目前较多用于研究激素与受体结合的机理。在传染病学方面广泛用于乙型肝炎抗原的亚型分类测定。在临床免疫学上测定免疫球蛋白 G、免疫球蛋白E及抗脱氧核糖核酸抗体;进一步的应用包括甲状腺球蛋白抗体、类风湿因子、补体及抗食物抗原抗体的测定。在肿瘤学方面用于测定癌胚抗原、血纤维蛋白溶酶原、叶酸、维生素B12以及血纤维蛋白原和血纤维蛋白降解产物。根据已建立的人绒毛膜促性腺激素、癌胚抗原和甲胎蛋白的RIA结果,为有效地初筛和在手术后追踪释放这些蛋白质的肿瘤提供了参考依据。在药理学方面可测定吗啡、氯丙嗪、苯妥英钠、庆大霉素、地高辛、茶碱等，是检测药物中毒和药物代谢的一个比较迅速和简便的方法。

优缺点

RIA法的优点是灵敏、特异、简便易行、用样量少等，常可测至皮摩尔。本法虽然也用放射性物质，但一般都是在测试样品时再加入标记的同位素示踪物，此示踪物的放射性强度极低，一般不会对实验者引起辐射损伤。本法的缺点是有时会出现交叉反应、假阳性反应，组织样品处理不够迅速，不能灭活降解酶和盐及pH有时会影响结果等。

展望

在本法的基础上，近年来又发展了其他免疫分析法，用其他有特殊性质的物质代替放射性同位素来标记抗原，同样利用标记与未标记抗原与抗体的竞争性结合，然后用适宜方法测定。其中研究较多的是荧光免疫分析，采用荧光化合物标记抗原，结合分离后通过荧光值的测定进行定量分析。

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