木瓜凝乳蛋白酶

在酸性、中性、碱性环境下均能分解蛋白质的蛋白酶

木瓜蛋白酶是一种在酸性、中性、碱性环境下均能分解蛋白质的蛋白酶。它的外观为白色至浅黄色的粉末，微有吸湿性。它既有很强的蛋白水解催化活性又含凝乳和溶菌活性,还具脂解能力及蛋白合成功能,主要是催化蛋白质水解,也能分解小肽。它的切割分解点很多,大致优先分解精氨酶,苯丙氨酸的肽键。

产品介绍

1941年，Jansen等首先从木瓜乳汁中提取到一种新半胱氨酸酶，并根据其凝乳能力与蛋白质水解能力之比是木瓜蛋白酶二倍的特点把它命名为木瓜凝乳蛋白酶。

木瓜凝乳蛋白酶(Papain由番木瓜乳液（papayalatex）分离而得的巯基蛋白酶末。分子量36000。PH值10.1。易溶于水，在低于PH值1.8溶液中十分稳定，最适PH值2.5～4.0。为一种蛋白水解酶。蛋白分解活性是木瓜蛋白酶的两倍。目前应用较多的是它的蛋白分解活性和凝乳作用。

木瓜凝乳蛋白酶可用于Rh血型的鉴定、啤酒的澄清和奶酪的制造等方面，然而其最主要的用途是治疗腰椎间盘突出症。临床用于抗炎消肿和治疗椎间盘病。最适pH6.0～8.0,最适温度70℃左右,半胱氨酶,硫化物,亚硫酸盐,乙二胺四乙酸能增加它的功效,人们常用此类物质促进它作用。表面活性物质(如去污剂、洗衣粉),氧化剂(如双氧水),有机溶剂(如石油醚、酒精),重金属盐,强酸、强碱乃至抗坏血酸,及各种微生物污染都能使它失活,应尽量避免接触。

成分结构

结构与木瓜乳汁中其他酶类似

现已发现木瓜乳汁中含有4种半胱氨酸酶:木瓜蛋白酶(EC3.4.22.2)、caricain(EC3.4.22.30)、glyeylendopeptidase(EC3.4.22.25)和木瓜凝乳蛋白酶(EC3.4.22.6)。作为4种已知半胱氨酸酶之一，木瓜凝乳蛋白酶与其他3种酶在氨基酸序列、肽链结构、活性中心和二硫键的保守性以及酶学性质等方面都有着很大的相似性，尤其是和木瓜蛋白酶第一样具有凝乳和蛋白质水解特性。

1967年，Kunimitsu等根据木瓜凝乳蛋白酶从离子交换柱洗脱的先后顺序把它分为木瓜凝乳蛋白酶A和木瓜凝乳蛋白酶B。B型与双质子态探针反应的二级速度常数K与pH的关系曲线与其他半胱氨酸酶的类似，在pH为3~4时K最大，在pH为6时K最小，在大约pH为9的碱性介质中，K略高，曲线平缓。而在A型的pH-K曲线中，在低pH时的钟形曲线的顶部消失了。pH-K曲线的不同及某些pH对应K值的不同是鉴别这两种不同类型酶的简单而有效的方法。正由于它们催化活性位点的特征不同，即使木瓜凝乳蛋白酶的名样性被发现后，这种A、B分类法仍然被沿用。

木瓜凝乳蛋白酶的结构与其他3种半胱氨酸酶类似，木瓜凝乳蛋白酶肽链的N末端有信号肽段和肽原段。信号肽指导木瓜凝乳蛋白酶向特异性细胞器分泌;肽原段不仅可以辅助酶肽链的折叠，可作为木瓜凝乳蛋白酶高亲和力的抑制剂，防止木瓜凝乳蛋白酶不合时宜地分解植物体内的其他蛋白质。

多数木瓜凝乳蛋白酶的多肽链由218个氨基酸组成，也有几种是由227个氨基酸组成的。多肽链折叠后，形成大小相当形状不同的两个域，L域和R域。L域主要是α螺旋结构，R域主要是反向平行的β折叠结构。活性部位位于两域的接触面上，活性中心的Cys5位于L域内由24~42残基构成的α螺旋上。

多肽链的8个半胱氨酸中有6个配对构成3个二硫键。位于必需活性位点的Cys25和位于非必需活性位点的Cys117没有参与二硫键的形成。具有催化功能的Cys25和保守的Cys23和Cys65组成了S1微场所。由于S1微场所的“口袋”比较大，对酶的底物特异性几乎没影响。目前认为由67、68、69、133、157和207几个位点的残基构成的S2微场所影响着酶的底物特异性。在其他3种半胱氨酸酶的S2微场所中高度保守的Val33和Val57在木瓜凝乳蛋白酶中被Leu所代替，这两个Leu很大程度上改变了S2微场所的几何形状，从而影响着酶的特性。

产品性质

盐酸胍广泛用于检测蛋白质可逆伸展的构象稳定性。木瓜凝乳蛋白酶的天然构象是其水解酪蛋白的最佳作用状态。盐酸胍的加入可能使木瓜凝乳蛋白酶的硫氢键氧化为二硫键，酶[7活降低。甘油糖和聚乙二醇是多羟基的化合物，能形成很多氢键而对酶往往会有稳定作用。研究表明葡萄糖对木瓜凝乳蛋白酶有激活作用，而甘油和聚乙二醇却对其有抑制作用。木瓜凝乳蛋白酶具有较高的热稳定性，比其他3种酶都高，这可能与其在117位有一个自由的胱氨酸残基有关。从研究结果来看，木瓜凝乳蛋白酶在经过较高的温度处理后仍有酶活，值得进步开发利用。

酶的热稳定性

在pH7.0条件下，分别将酶放于60°C、70°C、80°C，每隔0.5h抽取一定量的酶液测定其活性。结果表明在80C条件下酶活性明显下降，在60摄氏度条件下酶活性接近原来的一半。

盐酸胍对酶活的影响

在酶液中分别添加不同低浓度的盐酸胍，测定其酶活。结果表明，低浓度的盐酸胍对木瓜凝乳蛋白酶没有激活作用，而有明显的抑制作用。

葡萄糖对酶活的影响

检测结果表明,不同浓度的葡萄糖对酶均有激活作用，在浓度为2%~4%之间最明显，当浓度大于6%以上，其激活作用趋于稳定。

产品特性

Cp（Chymopapain，木瓜凝乳蛋白酶）既有很强的蛋白水解催化活性又含凝乳和溶菌活性,还具脂解能力及蛋白合成功能,主要是催化蛋白质水解,也能分解小肽。它的切割分解点很多,大致优先分解精氨酶,苯丙氨酸的肽键。

热稳定性

Cp的热稳定性与其结构有关。Sumner等人的比较了Cp和其它三种酶的热稳定性，其顺序为:Cp>木瓜蛋白酶 Ω>木瓜蛋白酶>木瓜凝乳酶M。分析发现，它们的热稳定性与Pro/Gly 的比值有关，但Cp的稳定性要比根据Pro/Gly比值预测的高，这可能与它在117位有一个自由的胱氨酸残基有关。Philppe 等人10J用麦芽糖加上保护剂和Cp一起冻干，在室温下储存三年其活力保持恒定。

pH稳定性

Cp具有较好的低pH稳定性。在pH为3时仍有活力，而其它三种酶却已失活。Silvia 等人们专门研究了Cp在pH为1.1~ 3.0的高温失活动力学，发现其熵和焓的变化很大，而其它酶则不具有此特性。Daumantas 等人口还用芳香族磺化反应来保护Cp,避免它在酸性和高温环境中失活。

同源性

Cp和其它疏基蛋白酶一级结构比较同种类的Cp其级结构都相同，由218个氨基酸组成。它和其它三种酶有高度的同源性。木瓜蛋白酶的212个氨基酸残基中有127个和Cp相同，木瓜蛋白酶Q的216个氨基酸残基中有144个和Cp相同，木瓜凝乳酶M的216个氨基酸残基中有148个和Cp相同。Cp和木瓜蛋白酶Q、木瓜凝乳酶M一样在木瓜蛋白酶的168和169位之间有4个氨基酸残基，这些氨基酸残基延长了两个相邻的β片层。Cp中有8个胱氨酸和半胱氨酸残基，而其它三种酶只有7个胱氨酸残基。25 位的胱氨酸是活性位点残基，153和204.22和63、56和95位的半胱氨酸分别形成三个二硫键，并具有同样的保守性。Cp的117位的胱氨酸是自由巯基，不形成硫键。木瓜蛋白酶所必需的活性残基Cys25、Asp158、His159.Trp177、Asn175在Cp和其余两种酶中都存在。另外在Cp的C-未端还有两个残基(Phe217和Ala218)。

制备方法

木瓜凝乳蛋白酶是一种胞外酶，能分泌到乳汁中，所以可以直接从未成熟木瓜乳汁中用色谱柱法分离纯化。但由于木瓜凝乳蛋白酶和其他3种半胱氨酸酶的结构相似，而且自身又含有多种类型，所以提取高纯度的木瓜凝乳蛋白酶非常困难，不同条件下提取的木瓜凝乳蛋白酶经常含有不同的杂蛋白质。已证明早期的木瓜凝乳蛋白酶制剂中就含有其他蛋白酶，过敏反应在很大程度上是这些杂蛋白质引起的。

Mark曾成功地将木瓜凝乳蛋白酶的基因重组到大肠杆菌中，得到的木瓜凝乳蛋白酶84%具有活性。

应用领域

国际上作工业用途的木瓜酶都指末纯化品,是成分复杂的多酶体系,蛋白电泳带大多在5条以上;其中含木瓜蛋白酶,木瓜凝乳蛋白酶A和B(ChymopapainAandB),木瓜肽酶A(PapayapeptidaseA)。木瓜酶广泛应用于轻纺、食品、啤酒、饲料、化工及医药。

轻纺方面

常用于绢丝脱胶和羊毛防缩,据我们的经验,可选用每毫升200单位(改良劳力法,下同)的酶液于pH7.0,70℃处理绢丝,绢织品、生丝、绢麻、绢及绢与醋酸纤维之类的混纺织物,时间大约30～40分钟,此法还可用到榨蚕丝、粗巢丝。应用工艺大致如下(因原料、方法不同而有所差异): 前处理→拧干→精炼→拧干→后处理→温水洗→水洗

由于木瓜蛋白酶只溶解丝胶而对纤维蛋白全无作用,所以能令丝织物等滑爽柔软。

羊毛防缩需作表面处理以脱去胶质或减少胶质含量。一般需先用木瓜酶加活化剂并用有机溶剂处理,随后以聚亚胺脂类作用。国外常用毛纤维含量1200%的C2Cl2,0.5%60万单位的木瓜酶和单乙醇胺、焦亚硫酸盐,60℃处理10分钟,甩干后浸入1200%C2Cl2和合成浆料LKF室温作用6分钟,清洗干燥后,羊毛及毛织物的收缩率将从对照的16%降到0～2.5%。

医药应用

木瓜凝乳蛋白酶最主要的用途是治疗腰椎间盘突出症。其作用机制是减少髓核中连接长链粘多糖的非胶原蛋白质的分子量和粘稠度，使粘蛋白发生去聚合作用，从而溶解突出的髓核。

1964年，Smith首次将木瓜凝乳蛋白酶用于治疗腰椎间盘突出症，成功率为70%。到目前为止，美国、加拿大、澳大利亚及欧洲的一些国家已有60余万患者接受了木瓜凝乳酶溶核术治疗。我国的滦波8和金今[9等用韩国新丰制药公司生产的木瓜凝乳蛋白酶进行治疗腰椎间盘突出的临床研究，也分别得到了70%和89%的优良率。将木瓜凝乳蛋白酶与其他手术相结合治疗腰椎间盘突出，可提高疗效和减少因注射部位不准确而引起的并发症，从而提高优良率。

木瓜凝乳蛋白酶治疗腰椎间盘突出症有时会引起严重的并发症，如过敏反应和神经系统并发症，这使它的应用受到了一定的限制。治疗前询问病人的过敏史、做过敏试验以及治疗过程的严格操作是及其重要的。

可将木瓜酶与其他成分配伍做成肠溶胶囊,口服达抗炎、消肿目的;也可将木瓜酶单独做成片剂、含片剂用于驱除肠道寄生虫或接触消炎;还可用木瓜酶将动植物蛋白水解成危重病人易于吸收的水解蛋白。

一些化工厂以明胶、骨胶作原料,100公斤原料粉碎后加水至湿润,用1公斤60万单位/g的木瓜酶粉与原料充分拌匀,于60℃水解40分钟,冷却后再加热一次至沸腾,加水助滤榨出滤液即为水解蛋白液,将此液去热源、灭菌,可供病人作输液用。

如做成每片含相当于50mg木瓜蛋白酶,2g胆木,1g田七的药片,能用于治疗骨外伤和痔瘘病患等,经广东新会市中医院临床试验,在53例单纯性骨折患者中效者23人,有效者28人。用于软组织挫伤病人12例,显效者8人,有效者4人,而经治疗的嗯喉炎患者,每一例都达显效,表现出良好的应用前景。

兽药方面

,华南农业大学与广西亚热带作物研究所协作,用木瓜酶、抗菌素和凡士林作膏剂,对百多例深层蹄心部化脓性外伤的奶牛进行治疗,酶将严重阻隔药物进入的疮痂分解,令抗菌素直接触及创面细菌,治愈了广州朱村奶牛场病患达几个月的顽固蹄腐病牛,开创了木瓜酶兽药的先河。作为啤酒工业应用,可在发酵初期添加木瓜酶达到降低麦芽用量。添加量一般为每吨辅料加入酶120～150g及加入a—淀粉酶1.5～2公斤。也可在后发酶结束至装罐前加入木瓜蛋白酶,用量为酒量的百万分之五,此时,即可获得防止啤酒冷混浊良效。

食品方面

上还能广泛用于以下工艺。由于木瓜酶可以水解面粉中的蛋白而使面粉发酵时的面筋粘度降低,制成的饼干会更加膨松酥脆,100公斤面粉加入木瓜蛋白酶量约0.8公斤即可,而且可用活性较低的酶。

将木瓜酶配进食盐、淀粉等做成的肉类嫩化剂可将淘汰的老家禽、家畜肉烹调时嫩化。若以木瓜酶水剂,甚至可以宰杀前用静脉注射方法将老鹅、水牛等肉质欠佳的动物肉大大改善。美国市场上销售的牛肉若经宰前木瓜酶处理,价格就要比不处理的高三倍以上。且一头牛的酶用量仅需1克不足,成本之低效果之佳令人惊叹。在猪、鸡等禽畜饲料中加入少量的木瓜蛋白酶后,饲喂时饲料中的蛋白质就更易于被消化吸收,达到省料快长的目的。一般每吨饲料加入低档次木瓜蛋白酶约1公斤效果即很明显。国外此法已相当普及,国内加酶饲料也逐步进入市场。

日用化工

用木瓜蛋白酶配合以多元醇作保护剂、保湿剂,制成护肤化妆品,利用该酶对死皮强烈清除分解而不伤及正常皮肤的特性,达到使用者皮肤鲜嫩柔和。若在护肤用品中加入以木瓜酶水解过的明胶、皮胶等,因为这类富含脯氨酶、羟脯氨酸的蛋白已分解到平均分子量2000以下,使小分子多肽营养能直接通过皮肤吸收,而可达养颜功能。目前这样的护肤品早已获女孩子青睐,连男士也开始向往了。

木瓜蛋白酶的用途很多,且人们还不断在发现开发新用处新途径,相信不久的将来,它将会更好地发挥作用造福于人,应用量也将跟着扩大。

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