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核酸电泳

分子生物学术语

带电荷的物质在电场中的趋向运动称为电泳。核酸电泳是进行核酸研究的重要手段，是核酸探针、核酸扩增和序列分析等技术所不可或缺的组成部分。核酸电泳通常在琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶中进行，浓度不同的琼脂糖和聚丙烯酰胺可形成分子筛网孔大小不同的凝胶，可用于分离不同分子量的核酸片段。

概念简介
凝胶电泳操作简便、快速，可以分辨用其它方法(如密度梯度离心)所无法分离的核酸片段，是分离、鉴定和纯化核酸的一种常用方法。
分类
琼脂糖凝胶电泳
1.原理　琼脂糖是从海藻中提取出来的一种线状高聚物。将琼脂糖在所需缓冲液中加热熔化成清澈、透明的溶胶，然后倒入胶模中，凝固后将形成一种固体基质，其密度取决于琼脂糖的浓度。
将凝胶置电场中，在中性pH值下带电荷的核酸通过凝胶网孔向阳极迁移，迁移速率受到核酸的分子大小、构象、琼脂糖浓度、所加电压、电场、电泳缓冲液、嵌入染料的量等因素影响。在不同条件下电泳适当时间后，大小、构象不同的核酸片段将处在凝胶不同位置上，从而达到分离的目的。琼脂糖凝胶的分离范围较广，用各种浓度的琼脂糖凝胶可分离长度为200bp至50kb的DNA。
2.琼脂糖凝胶电泳的仪器及试剂　仪器设备应包括水平凝胶电泳槽及其配套电泳梳、稳压电泳仪、微波炉或普通电炉。同时配备紫外线检测仪和照相系统。
试剂包括琼脂糖、电泳缓冲液、溴化乙锭溶液、凝胶加样缓冲液。
电泳缓冲液常用TBE(1 000ml中含5.4g Tris，2.75g硼酸，2ml 0.5 mol/L EDTA，pH8.0)。
溴化乙锭(ethidium bromide，EB)是一种荧光染料，它可以嵌入核酸双链的配对碱基之间，在电泳过程中随核酸片段迁移，将凝胶置紫外光下，插入核酸链中的EB在紫外线激发下产生红色荧光，可清楚显示各核酸片段的迁移。EB见光易分解，应存棕色试剂瓶中于4℃下保存。由于 EB是一种强的诱变剂并有中度毒性，使用时必须戴手套操作。
常用的凝胶加样缓冲液有4种，见下表：
3.凝胶的制备和电泳
操作方法如下：
(1) 用透明胶将玻璃板或电泳装置所配备的塑料盘的边缘圈封，制成胶模，置水平工作台上；
(2) 称取适量琼脂糖，置电泳缓冲液中，加热使琼脂糖溶解；
(3) 待溶液冷至60℃，加入10mg/ml EB贮存液，使终浓度达0.5mg/ml；
(4) 在距离胶模底板0.5-1mm处放置电泳梳，将琼脂糖溶液倒入胶模中，厚度约3-5mm，注意避免产生气泡；
(5) 凝胶完全凝固后，移去梳子和透明胶，将凝胶放入电泳槽。加入TBE缓冲液使恰好没过胶面约1mm；
(6) 将DNA样品与1/6体积加样缓冲液混合后，加入样品槽中；
(7) 接通电源，使样品槽在负极端，用1-5v/cm的电压，电泳适当时间；
(8) 电泳结束后，可将含EB的凝胶直接放在紫外线检测仪上观察，并拍照记录，也可将不含EB的凝胶在0.5μg/ml的EB溶液中染色30-45分钟，再如上观察和拍照，记录结果。
4.凝胶摄影
需配置135照相机，全色135胶卷，照相机固定架，近摄镜和红色滤光镜以及有机玻璃防护面罩。
操作需在暗室进行，将相机固定好，把凝胶放在紫外检测仪上适当位置，调焦，装上红色滤光片，按常规拍照。
亦可使用凝胶自动处理系统，但仪器费用较高。
5.EB溶液的净化处理
由于EB具有一定的毒性，实验结束后，应对含EB的溶液进行净化处理再行弃置，以避免污染环境和危害人体健康。
(1) 对于EB含量大于0.5μg/ml的溶液，可如下处理：
①将EB溶液用水稀释至浓度低于0.5μg/ml；
②加入一倍体积的0.5mol/L KMnO4 ，混匀，再加入等量的25mol/L HCl，混匀，置室温数小时；
③加入一倍体积的2.5mol/L NaOH，混匀并废弃。
(2) EB含量小于0.5μg/ml的溶液可如下处理：
① 按1mg/ml的量加入活性炭，不时轻摇混匀，室温放置1小时；
② 用滤纸过滤并将活性碳与滤纸密封后丢弃。
聚丙烯酰胺凝胶电泳
1.原理　聚丙烯酰胺凝胶通过丙烯酰胺单体、链聚合催化剂N，N，N’，N’-四甲基乙二胺(TEMED)和过硫酸铵以及交联剂N，N’-亚甲双丙烯酰胺之间的化学反应而形成。丙烯酰胺单体在催化剂作用下产生聚合反应形成长链，长链经交联剂作用交叉连接形成凝胶，其孔径由链长和交联度决定。链长取决于丙烯酰胺的浓度，调节丙烯酰胺和交联剂的浓度比例，可改变聚合物的交联度。
聚丙烯酰胺凝胶电泳可根据电泳样品的电荷、分子大小及形状的差别达到分离目的，兼具分子筛和静电效应，分辨力高于琼脂糖凝胶电泳。可分离只相差1个核苷酸的DNA片段。
聚丙烯酰胺凝胶电泳用于分析和制备长度小于1kb的DNA片段。根据所要分离的核酸片段大小，可制备不同浓度的凝胶。
2.凝胶的制备和电泳　由于氧能抑制丙烯酰胺的聚合反应，灌制聚丙烯酰胺凝胶常在两块封闭的玻璃平板所形成的夹层间进行。在这种装置形式下，仅有顶层的凝胶与空气中的氧气相接触，从而大大减少了氧对聚合的抑制作用。聚丙烯酰胺凝胶电泳一般采用垂直装置。
凝胶的制备和电泳操作如下：
(1) 配制试剂
① 30%丙烯酰胺：100ml双蒸水中含29g丙烯酰胺和1g N，N’-亚甲双丙烯酰胺。
② 5×TBE　每升溶液含54g Tris.HCl，27.5g硼酸和20ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)。
③ 10%过硫酸铵：10ml双蒸水中含1g过硫酸铵。
(2) 装置胶模　将玻璃板和垫条事先用去污剂刷洗，并经自来水和无离子水冲洗干净，晾干。装置时，将较大的玻璃板平放在工作台上，将两个垫条放在玻璃板两侧，涂上少量凡士林，并将上层玻璃板置于垫条上，用夹子将玻板连同垫条夹紧，底部用1%琼脂糖密封。为防止漏胶，除放梳子一边外，其余三边应用防水胶带密封。
(3) 根据玻璃板大小及夹层厚薄计算所需凝胶溶液量，按下表配制溶液(100ml)。
将35μl TEMED加入100ml混合液中，混匀，然后均匀连续注入两玻璃板空隙中。
(4) 立即插入电泳梳，勿使梳齿下形成气泡。
(5) 室温聚合1小时，梳齿下出现折光带时，表明聚合反应已经完成。若凝胶不立即使用，可用纱布或滤纸(用1×TBE浸泡)包盖于凝胶顶部，置4℃保存1-2天。
(6) 拔去梳子，立即用水冲洗加样孔。
(7) 除去底部胶带，将凝胶直立放入电泳槽。在上下两槽中灌好1×TBE溶液，驱尽凝胶底部附着的气泡。并用1×TBE溶液冲洗加样孔；
(8) 将核酸样品与适量6×凝胶加样缓冲液(见表2-28)混合，并加入凝胶加样孔中；
(9) 接通电源，正极与下槽连接。电压一般控制在1.8v/cm。电压过高时凝胶产生的热量可造成DNA区带弯曲，甚至引起小DNA片段的解链；
(10) 电泳毕，取下玻板和凝胶，放在工作台上，从夹层一角轻撬，将上面的玻板轻轻移开，并小心揭下凝胶，置染色液中染色并进行结果观察。
3.凝胶的染色和观察　聚丙烯酰胺凝胶中核酸带的染色，常用溴化乙锭法和银染法。前者与琼脂糖凝胶的染色方法相同。
银染法的灵敏度较高，可如下操作：
(1) 将凝胶置固定液(10%乙醇，0.5%冰醋酸)中固定10分钟；
(2) 双蒸水洗1-2次；
(3) 置0.01mol/L AgNO3溶液中，室温反应15-30分钟；
(4) 充分水洗；
(5) 置NaOH-甲醛混合液(200ml 3%NaOH，含1ml甲醛)中反应至条带显色清晰，本底适宜；
(6) 用5%冰醋酸终止反应。
应用范围
琼脂糖凝胶电泳适合分离、纯化200bp-50kB长度的核酸片段，广泛应用于基因组提取与分析、载体构建、质粒提取等方面，分辨率较低，相差100bp以内的核酸片段较难分离。
聚丙烯酰胺凝胶电泳适合分离1kB以下的小核酸片段，适用于序列分析与比对、核酶分析与鉴定、小片段核酸的提取与分析等方面分辨率较高，可以精确分离相差十几至几十bp的小片段核酸分子。
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