水解纤维素

纤维素水解的产物

纤维素水解的产物称为水解纤维素，它不是一种有固定组成的化合物，而是一种依水解程度不同而不同的混合物，纤维素完全水解即为葡萄糖。水解纤维素主要是由于纤维素在酸、酶等因素的作用下产生的，其化学结构与原纤维素相同，主要区别在于它的聚合度小于原纤维素，因此，水解纤维素的机械强度大大低于原纤维素。

纤维素酶的概念

1906年，Seilliere首次在蜗牛的消化液中发现了能分解天然纤维素的纤维素酶。1945年又在微生物中发现了此酶。到了20世纪六七十年代，科学家们针对世界人口猛增的形势，开始研究用纤维素酶使纤维索转化为食物，生产单细胞蛋白。第二次世界大战后，前苏联每年用于饲料的单细胞蛋白高达200万吨。进人20世纪90年代，世界范围的能源枯竭和环境污染日益严重，纤维素酶的研究重点又转变为开辟新能源及防止废纤维污染。有人将纤维索酶的研究分为三个阶段(阎伯旭等,1999)：第一阶段是20世纪80年代前，主要利用生物化学的方法对其进行分离纯化；第二阶段是1980- 1988年期间,主要利用基因工程的方法对酶的基因进行克隆和一级结构的测定；第三阶段是1988年至今，主要利用结构生物学及蛋白质工程的方法对纤维索酶分子结构及功能进行研究。

纤维素酶类作为饲用添加剂,国外从20世纪70年代起开始对其进行较为系统的研究。由于纤维素酶的活性不高，用最过大，来源有限,致使生产成本过高而应用受到限制。20世纪80年代后期，由于酶的生产技术和菌种筛选、分子生物学的发展及生物技术取得了突破性进展，酶的活力单位提高，单位酶活力的生产成本不断下降，纤维素酶的应用研究才得以迅速展开，从而使其在饲料中的应用出现了新的前景。

纤维素酶的来源

纤维素酶是能将纤维素水解成葡萄糖的一组酶的总称，来源广泛，主要包括微生物来源、植物来源和动物来源纤维素酶。

1、微生物来源的纤维素酶

能分泌纤维素酶的微生物主要有霉菌、担子菌等真菌，也包括细菌、放线菌和一些原生动物。目前，人们研究的纤维素酶主要来自于细菌和丝状真菌(Wood，1992；Bhat和Bhat，1997)。细菌主要有纤维黏菌、生孢纤维黏菌和纤维杆菌等，但由于细菌分泌的纤维素酶量少(低于0.1 g/L)，同时产生的酶属胞内酶或者吸附于细胞壁上，故很少用细菌作纤维素酶的生产菌种。丝状真菌则能较大量地产生纤维素酶，且能分泌到细胞外，属胞外酶，这有利于酶的提取。

利用微生物生产纤维素酶的研究开展较早。早期许多研究集中在利用绿色木霉(、康氏木霉、青霉等嗜温好氧真菌产纤维素酶。对纤维素作用较强的菌株多是木霉属、青霉属、曲霉属和枝顶孢霉的菌株，特别是绿色木霉及其近缘的菌株。目前饲用纤维素酶主要来源于绿色木霉、李氏木霉、根霉、青霉、嗜纤细菌、侧孢菌等，其中绿色木霉应用最为广泛。

2、植物来源的纤维素酶

植物可以产生纤维素酶的观点早已被人们所认识和接受。在植物中，纤维素酶在植物发育的不同阶段发挥着水解细胞壁的作用，如果实成熟、蒂柄脱落等过程。柴国花等(2006)采用RT-PCR检测培养4周的大豆幼苗的5个不同组织：嫩叶、老叶、茎、离层和根，测得脱落纤维素酶基因的表达量互不相同，离层中表达量最高，茎中表达量最低。同时选取表达量最高的离层作为逆境处理材料，分别用高温、干旱、盐处理不同时问后，检测脱落纤维素酶基因的时间表达模式，结果表明：3种逆境条件下，脱落纤维素酶基因的时间表达模式各不相同，但总的来说，高温能抑制脱落纤维素酶基因的表达，干旱和盐都能促进脱落纤维素酶基因的表达。目前关于谷物性饲料中是否存在纤维素酶及其对畜禽消化影响的研究并不多见．对植物源纤维素酶的酶活及其调控研究将有助于研究植物源和微生物源纤维素酶的差异并进一步开发高效纤维素酶菌种。

3、动物来源的纤维素酶

动物来源纤维素酶包括在动物消化道内寄生微生物分泌的纤维素酶和动物自身分泌的纤维素酶。反刍动物依靠瘤胃微生物可消化纤维素，因此可以利用瘤胃液获得纤维素酶的粗酶制剂。张晓华等(1995)报道了一个厌氧中温分解纤维素的瘤胃梭菌新种。Nakashima等(2000)从白蚁体内分离到一种相对分子质量为48000的内切β-1，4-葡聚糖酶。王骥(2003)从福寿螺体内分离得到一种同时具有外切β-1，4-葡聚糖酶、内切β-1，4葡聚糖酶和内切β-1，4一木聚糖酶3种酶活性，相对分子质量为41500的多功能纤维素酶，同时在福寿螺的卵母细胞中获得了编码该酶的基因。上述研究证实动物自身可分泌内源性纤维素酶，这可能是动物在进化过程中对自然环境的适应性选择，对高等动物猪、鸡等而言自身分泌的纤维素酶有限。

4、液体发酵产纤维素酶

液体发酵的突出优点是便于控制污染，尤其是目前常用的液体深层发酵技术，另外就是产生的纤维素酶纯度高、便于浓缩成高浓度的产品。液体发酵节省劳动力、适合于大规模工业化生产，但大规模生产时，发酵罐的搅拌桨不停地搅拌耗能是相当巨大的。液体发酵的培养周期长，至少长达7～8 d，更多的长达11 d以上(丹尼尔等，1984)。

5、固体发酵产纤维素酶

固体发酵的基本流程是：菌种平板一摇瓶一种曲一固体发酵。固体发酵产纤维素酶的特点是：由于发酵条件更接近自然环境状态下的微生物生长习性，使得其产生的酶系更全面，有利于降解天然纤维素；在设备、耗能、投资、生产成本方面国内外许多丁-厂的建立已说明比液体发酵优越得多；固体发酵不需搅拌，培养周期短，只培养3 d，且在不含游离水的条件下培养，水分为75%。但是，固体发酵比液体发酵较难控制污染，不过随着近几年技术发展，固体发酵污染相对较难控制的问题，已得到很大的改进。

我们在2004年的研究中分别选择了1种固体发酵纤维素酶和2种液体发酵纤维素酶，均来源于真菌。比较而言，固体发酵获得CMCase活力较高，但总的FPase反而液体发酵较高；此外，液体发酵来源纤维素酶具有比固体发酵更好的稳定性，表现在抗逆性和热稳定性等方面(黄燕华，2004)。

纤维素酶降解纤维素的机理

关于纤维素酶降解纤维素作用机制的假说很多，在对纤维素酶各组分间作用顺序和部位及协同作用的分子学机理等方面的假说存有较大异议，但对于各组分间存有很强的协同作用及部分单一组分酶的水解效果具有一定的共识。

1950年，Reese等提出了由于天然纤维素的特异性而必须以不同的酶协同作用才能分解的C1-Cx假说。这个假说认为：当纤维素酶作用时，首先C1酶(内切葡聚糖酶)首先作用于纤维素结晶区，使其转变成可被Cx酶(外切葡聚糖酶)作用的非结晶区，Cx酶随机水解非结晶区纤维素，然后β-1，4一葡萄糖苷酶将纤维二糖水解成葡萄糖。Wood(1985)在研究木霉、青霉的纤维素酶水解纤维素时，发现培养液中的两种外切酶在液化微晶纤维素和棉纤维时具有协同作用。Kanda等(1976)还发现了只是对可溶性纤维素进攻方式不同的两种内切葡萄糖苷酶在结晶纤维素的水解过程中也具有协同作用。协同作用一般认为是内切纤维素酶首先进攻纤维素的结晶区，形成外切纤维素酶需要的新的游离末端。然后外切纤维素酶从多糖链的非还原性末端切下纤维二糖单位，β-葡萄糖苷酶再水解纤维二糖单位，形成葡萄糖。一般来说，协同作用与酶解底物的结晶度成正比，当酶组分的混合比例与霉菌发酵滤液中各组分比相近时，协同作用最大，不同菌源的内切与外切酶之间也具有协同作用(Henrissat等，1995)。目前最易接受的酶水解机理如图1所示

但是，根据Pettersson等(1969)报道，在水解天然纤维素过程中，起关键作用的实际上是外切葡聚糖酶(Cx)，并提出天然纤维素的水解是从内切型的β-1，4一葡聚糖酶(C1)开始的。C1酶首先在微纤维上一些特定的薄弱位置把纤维素分子链打开，C1酶接着深入到纤维素分子链把氢键断开，这样，就使一段段的纤维断片从微纤维上脱落下来，脱落的纤维素断片再经Cx和β-葡萄糖苷酶作用，形成葡萄糖。此外，Mandels等(1964)作了如下推测，认为首先由C1和Cx酶形成的复合体，共同对纤维素进行水解，生成物放出时复合物解离，然后一个酶单独吸附到纤维素上，这种酶就不再有活性了。

近年来，应用凝胶过滤、离子交换层析、凝胶电泳以及等电聚焦等生化分离分析手段，发现纤维素酶非常复杂。研究发现，内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶及β-葡萄糖苷酶均存在2～4个同功酶，对于这些同功酶的功能，目前尚未有明确的阐述。

水解纤维素试验

水生细菌有的具有分解纤维素的能力，通常认为，能在以纤维素作为唯一碳源的培养基上生长的细菌必然含有纤维素酶，即能分解纤维素，如纤维分解细菌等具有分解纤维素的能力。故而可利用此类细菌的这种特性来鉴定它们。鉴定时以不含碳源的培养基为宜，下举两种。

1、无机盐培养基

NH4NO3 1.0克

K2HPO4·3H2O 0.5克

KH2PO4 0.5克

MgSO4·7H2O 0.5克

NaCl 1.0克

CaCl2 0.1克

FeCl3 0.02克

酵母膏 0.05克