环介导等温扩增技术

环介导等温扩增技术，英文名称为loop-mediated isothermal amplification，能在等温（60-65℃）条件下，短时间（通常是一小时内）内进行核酸扩增，是一种“简便、快速、精确、低价”的基因扩增方法。

与常规PCR相比，不需要模板的热变性、温度循环、电泳及紫外观察等过程。环介导等温扩增法是一种全新的核酸扩增方法，具有简单、快速、特异性强的特点。该技术在灵敏度、特异性和检测范围等指标上能媲美甚至优于PCR技术，不依赖任何专门的仪器设备实现现场高通量快速检测，检测成本远低于荧光定量PCR。

LAMP法的特征是针对靶基因上的六个区域设计四条引物，利用链置换型DNA聚合酶在恒温条件下进行扩增反应，可在15-60分钟内实现109-1010倍的扩增，反应能产生大量的扩增产物即焦磷酸镁白色沉淀，可以通过肉眼观察白色沉淀的有无来判断靶基因是否存在。LAMP方法的优势除了高特异性和高灵敏度外，操作还十分的简单，在应用阶段对仪器的要求低，一个简单的恒温装置就能实现反应，结果检测也非常简单，直接肉眼观察白色沉淀或者绿色荧光即可，不像普通PCR方法需要进行凝胶电泳观察结果，是一种适合现场、基层快速检测的方法。

扩增原理

LAMP 技术扩增反应的具体过程比较复杂，下文将结合图2所示，按具体的反应过程对其LAMP原理进行详解。

在启动阶段，双链DNA 模板在等温（60～65℃）的条件下，内部引物FIP退火，FIP中的F2序列跟模板链上Flc位点结合（2），在具有链置换活性的DNA聚合酶作用下启动核酸的合成（2），外部引物m也缓慢地退火，与目的序列杂交（3），启动链置换反应，产生一条双链DNA（4），并置换释放一条单链DNA（5）；单链DNA一端自动形成环的结构（5），可作为BIP引物的模板， BIP启动链的合成，随后B3引物退火，同模板链杂交（6），引导链置换反应产生一条双链DNA（7）和一条两端成环的单链DNA，形成一个哑铃环的结构（8）；此后，3 端自动引导DNA的合成，快速形成一种茎－环的结构（9），该结构作为LAMP反应中循环反应的起始结构，进入LAMP反应的循环扩增阶段。

在循环扩增阶段主要是两个内部引物起作用，引导扩增反应。FIP退火到茎·环结构（9）上，引导链置换DNA合成反应，产生结构（10）的产物；随后产物（10）的3端自动引导链置换DNA的合成，生成产物（11）和与开始的产物（8）序列互补的哑铃环结构（12）；产物（11）和（12）都可做为BIP引物的模板，一个进入延伸循环步骤，形成花椰菜状的结构（13），另一个重复（8）-（10）的过程，生成产物（14）和（15）；产物（15）再以自身为模板，3’端自动引导链置换DNA的合成，生成产物（16）和最初的产物（8），产物（8）开始新一轮的循环扩增，产物（16）进入延伸循环步骤，形成类似（13）花椰菜状的结构（17）；内部引物又可以产物（13）和（17）作为模板，引导链置换DNA的合成，使产物的序列不断延伸、环化、再延伸，最终的产物是一些具有不同茎长度茎环结构的DNA和带有许多环的类似花椰菜结构的DNA的混合物。

应用

细菌类病原微生物的检测，病毒类病原微生物的检测，真菌类微生物的检测，现场病原寄生虫的检测，转基因产晶成分检测

LAMP技术虽然是一种新的核酸扩增技术，但其在分子生物学检测领域的应用非常广泛，相对于现有的其他核酸扩增技术，LAMP具有许多独特的优点：

（1）LAMP技术可以在等温条件下实现扩增，不需要进行模板的预变性，减少了PCR技术升降温带来的影响以及对昂贵、精密实验仪器的要求，同时扩增效率高，可以在1 h内把几拷贝的目的序列迅速扩增到10拷贝；

（2）LAMP技术分别使用一对外部引物和一对内部引物，可以识别目的序列上6个不同的区域，对目的序列具有高度的选择性，减少了非靶标序列的影响，因此扩增的特异性非常高；

（3）阳性扩增反应中会产生大量的类似花椰菜结构的产物和白色焦磷酸续沉淀，扩增产物的检测方法多样，可用凝胶电泳检测、直接用肉眼检测或在反应体系中加入染料，根据颜色的变化进行检测，还可以利用浊度仪，根据扩增产物混浊度的不同对原始核酸分子进行实时定量分析。此外，对于某些病原体可直接利用简单处理的样本作为模板，省略繁琐的DNA/RNA提取步骤。综上所述，LAMP技术因其快速、高效、特异、灵敏和经济等优点，已经应用于病原菌、寄生虫、病毒、疾病和转基因产品检测等领域，并且还将广泛应用于临床诊断、环境监测、食源安全等领域，具有更为广阔的发展应用前景。

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