苹果酸-乳酸发酵

化学物质

苹果酸-乳酸发酵（Malolactic fermentation，MLF）指在乳酸菌作用下将L-苹果酸脱羧基形成 L-乳酸的过程，是葡萄酒生产难以控制的二次发酵过程，主要由酒类酒球菌引起。MLF对大部分红葡萄酒、一些白葡萄酒和汽酒最终的质量有重要的影响。自发进行的MLF结果往往难以预测，甚至引起葡萄酒的腐败。MLF可降低葡萄酒的pH值，产生香气物质使葡萄酒的感官性状发生改变，并保持葡萄酒的微生物稳定性。随着对引起MLF发生机理的认识和相应发酵剂的研究成功，MLF正越来越多的应用到葡萄酒酿造实践中，对酿造高档葡萄酒起到了巨大的推动作用。

定义

苹果酸-乳酸发酵（Malolactic fermentation，MLF）指在乳酸菌作用下将L-苹果酸脱羧基形成 L-乳酸的过程，是葡萄酒生产难以控制的二次发酵过程，主要由酒类酒球菌引起。

在葡萄酒的酿造过程中，苹果酸-乳酸发酵不仅可降低生葡萄酒的酸涩和粗糙感，使之柔和、圆润，而且还提高了葡萄酒的感官质量和生物稳定性，所以，许多优质红葡萄酒甚至一些佐餐红葡萄酒都要进行苹果酸乳酸发酵。北方地区气候寒冷，苹果酸度较高，酿造出的苹果酒口感较酸涩，需要进行苹果酸乳酸发酵来改善其风味。相反，南方地区苹果酸度较低，有些酿酒师并不提倡进行苹果酸乳酸发酵，所以更多的酿酒师考虑的是苹果酸乳酸发酵对葡萄酒、苹果酒风味的贡献。

MLF所需微生物

乳酸菌LAB在自然界广泛存在，可存在于葡萄的果实和叶梗的表面。LAB为原核微生物，革兰氏染色阳性细菌，其生长繁殖需要从生物氧化中获得能量，当某化合物氧化时便失去电子，为平衡代谢某化合物接受电子而被还原。在苹果酸乳酸转化中，苹果酸是电子供体，而乳酸是电子的受体。LAB也能用丙酮酸作为电子受体，并产生乳酸。

MLF对葡萄酒品质的影响

降酸作用

MLF将氢离子固定在乳酸上可以使滴定酸度下降0.01g到0.03 g酒石酸酸度/L，pH增加0.3，这一点非常重要，因为如果葡萄酒pH低于3.5，LAB的代谢活性可以升高pH水平，从而使葡萄酒的酸度降低，改善葡萄酒的口感。

提高细菌稳定性

MLF可以提高葡萄酒中细菌的稳定性，MLF发生时由于营养物质的消耗或细菌素的产生其他微生物的生长受到抑制。MLF发生的时间也很重要，如果发生在葡萄酒装瓶之前，就可预防其在瓶中的生长。LAB在瓶中的生长或可引起葡萄酒浑浊、CO2产生，产生多糖导致酒体变黏，或pH提高促使其他腐败微生物的生长等。

风味的改善

葡萄酒经LAB发酵之后，不仅产生乳酸，也产生其他代谢产物，对葡萄酒的风味产生影响。在有限通风条件下，酒类酒球菌倾向于产生乳酸和乙醇，欲产生更多乳酸则要求更多的通风。然而，其他LAB在此条件下可能产生醋酸，醋酸本身有刺激性，所产生的醋酸的量非常重要，应避免超出感官检测的阈值。LAB产生的另一个重要的化合物是双乙酰，双乙酰有特征性的奶油风味。双乙酰的形成取决于前体物质的出现，可由乙醛和乙酰CoA反应形成，或丙酮酸和乙醛反应产生五碳的乙酰乳酸，后者进而再形成四碳的双乙酰分子和一分子CO2。LAB 发酵过程中可产生的 2，3-丁二醇来自乙偶茵，具有淡淡的苦啤酒的风味，通常在检测阈值以下。它的形成是一个还原的过程，即电子以乙偶茵和 2，3-丁二醇的形式固定。LAB 发酵过程中还产生乳酸乙酯、丙烯醛等，对葡萄酒的风味产生影响。在含氮丰富的果汁发酵时，葡萄酒中出现奶酪的风味。赖氨酸是酵母的重要营养，但过量添加会导致出现所谓的鼠臭味。一些植物乳杆菌和短乳杆菌代谢酒石酸为醋酸，产生所谓的败坏病，这些是葡萄酒酿造中不希望看到的。

影响因素

影响MLF的最主要的因素是pH，其影响除提供质子梯度外，它决定哪些种类的LAB会出现，影响生长的速率，当pH低至一定程度时就变为微生物的抑制剂。pH也影响微生物的代谢，在pH3.2以下时许多LAB分解苹果酸，在pH3.5时则进行糖的分解。在pH3.8时MLF的速率高于pH3.8以下时的速率，在pH3.2时比在pH3.8时慢10倍。有的菌株对pH有高的耐受性。在 pH3.5以下的葡萄酒中，酒类酒球菌是优势菌群，在较高的pH条件下乳杆菌和片球菌可以生存和生长。

SO2

LAB对SO2非常敏感，比酵母敏感的多。所有LAB具有相同的敏感性，酒球菌中没有耐受性菌株。SO2分子或其游离形式是其抑制剂形式。游离SO2的出现取决于pH，结合的SO2也对 LAB有抑制作用，但作用较小。酵母产生一定量的SO2，产生的亚硫酸盐量在20 mg/L以上，如果pH条件合适足以抑制LAB的生长。酒类酒球菌对亚硫酸盐的耐受性达30 mg/L，对低pH 耐受的菌比不耐受的菌生存的更好。在酸性培养基（pH3.5）中的适应性阶段加入亚致死浓度的亚硫酸盐(15 mg/L)，增加LAB对亚硫酸盐的适应性。

乙醇

LAB对乙醇的耐受性有一定的限制。一般情况下乙醇浓度为14%时LAB被抑制，但有的比较敏感。如果用晚收的葡萄或高白利糖度果汁进行MLF，需要在乙醇发酵前进行。一般而言，乙醇浓度越高MLF越慢。乙醇对LAB的苹果酸乳酸代谢有强烈的干扰作用，高的乙醇浓度降低LAB的最低生长温度，升高温度则降低乙醇耐受性。尽管在葡萄酒中的乙醇浓度（8 %-12 %，体积分数)不抑制MLF，但酒类酒球菌的生长速率随乙醇浓度的增加呈线性降低，14 %是大部分菌株乙醇耐受性的上限。酒类酒球菌乙醇耐受性的建立是复杂的，取决于休克的程度和期限，也取决于培养条件如培养基成分、pH、和温度。

温度

温度对MLF极其重要，LAB生长的最佳温度为20℃-37℃，15℃以下时生长受到抑制。在允许的范围内，温度越高生长越快，乳酸产生越高。温度影响LAB生长速率和迟滞期的长短，因此也影响LAB的数量。酒类酒球菌的最佳生长速率约在25℃。然而，预先在42℃培养处理，促进其在葡萄酒中的存活和进行MLF的能力，后一温度诱导其合成应激蛋白，许多应激蛋白作为分子伴侣或蛋白酶参与蛋白质的重新折叠或变性细胞蛋白的分解。在不同的生长条下，为了维持膜的最佳流体性，细胞调节其细胞膜的脂质成分。生长温度增加诱导饱和脂肪酸比例的增加，而不饱和脂肪酸减少。

氧和二氧化碳

分子氧对MLF的作用取决于微生物的种类，其刺激一些LAB的生长机理和酵母相似。葡萄酒生产时，有限的氧化作用似乎刺激MLF，然而，如果氧含量太高，并且如果有专性异型发酵微生物，可能导致产生醋酸。因此，在MLF中应限制进行通风操作以避免不期望的终产物的出现。LAB具有发酵代谢途径，在有氧的条件下通常生长不好。然而，一些明串珠菌菌株有氧培养时由于诱导性NAD（P）H-氧化酶的出现，生长良好。这些酶使得细胞从乙酰磷酸转变为醋酸获得ATP。其他LAB，如植物乳杆菌和乳酸乳杆菌从氧气不能获得益处，但氧气的出现也不抑制它们。严格的厌氧条件促进酒类酒球菌的生长，在充气条件下以葡萄糖作为惟一碳源不生长。氧使乙醇形成过程中的酶，乙醛脱氢酶和乙醇脱氢酶失活，因此，阻止异型乳酸发酵糖分解第一阶段中产生的辅酶的再氧化。而且，酒类酒球菌在有氧条件下缺乏重要的NAD（P）H-氧化酶活性，这些结果表明，对葡萄糖的有氧代谢辅酶的产生是限制性因子。加入果糖或丙酮酸，作为电子受体，轻微促进酒类酒球菌的生长。果糖转变为甘露糖，氧化两分子的NAD（P）H，丙酮酸转变为乳酸，使NAD+再生。CO2刺激LAB的生长，但其机理不清。

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