药敏试验

用药敏实验进行药物敏感度的测定，以便准确有效的利用药物进行治疗。目前，临床微生物实验室进行药敏试验的方法主要有纸片扩散法，稀释法（包括琼脂和肉汤稀释法），抗生素浓度梯度法（E-test法），和自动化仪器等。

简介

体外抗菌药物敏感性试验简称药敏试验（AST），是指在体外测定药物抑菌或杀菌能力的试验。

根据美国国家临床实验室标准化委员会(NCCLS)近期推荐的标准，对非苛氧菌（肠杆菌科细菌、铜绿假单胞菌、和其他非肠科杆菌、葡萄球菌属细菌、肠球菌属细菌）和苛氧菌（嗜血杆菌属细菌、淋病奈瑟菌、肺炎链球菌和其他链球菌）选择常规药敏试验的首选药物（A 组抗生素）或临床使用的主要抗生素（B组抗生素）进行药敏试验。

抗菌药对细菌性传染病的控制起到了非常重要的作用，但由于养殖过程中不科学的、盲目的滥用抗菌药，很多致病性细菌产生了耐药性，使得抗菌药对细菌性疾病的控制效果越来越差，不但造成药物浪费，而且还延误病情，给养殖户造成了很大的经济损失。

随着新型致病菌的不断出现，抗菌药的防治效果越来越差。并且各种致病菌对不同的抗菌药物的敏感性不同，同一细菌的不同菌株对不同抗菌药物的敏感性也有差异。长期以来，各种致病菌耐药性的产生使各种常用抗菌药物往往失去药效，以及不能很好的掌握药物对细菌的敏感度，所以一个正确的结果，可供临床医师选用抗菌药物的参考，并提高疗效。农业部动物检疫所青岛易邦生物工程有限公司动物疫病诊疗中心总结出几套适合基层进行药敏试验的操作方法，现简单介绍如下。

分类

纸片扩散法

该法是将含有定量抗菌药物的滤纸片贴在已接种了测试菌的琼脂表面上，纸片中的药物在琼脂中扩散，随着扩散距离的增加，抗菌药物的浓度呈对数减少，从而在纸片的周围形成浓度梯度。同时，纸片周围抑菌浓度范围内的菌株不能生长，而抑菌范围外的菌株则可以生长，从而在纸片的周围形成透明的抑菌圈，不同的抑菌药物的抑菌圈直径因受药物在琼脂中扩散速度的影响而可能不同，抑菌圈的大小可以反映测试菌对药物的敏感程度，并与该药物对测试菌的MIC呈负相关。

稀释法

稀释法药敏试验可用于定量测试抗菌药物对某一细菌的体外活性，分为琼脂稀释法和肉汤稀释法。实验时，抗菌药物的浓度通常经过倍比（lg2）稀释，能抑制待测菌肉眼可见生长的最低药物浓度成为最小抑菌浓度（MIC），一个特定抗菌药物的测试浓度范围应该包含能够检测细菌的解释性折点（敏感、中介和耐药）的浓度，同时也应该包含质控参考菌株的MIC.

2.1 琼脂稀释法首先制备含抗菌药物的琼脂稀释平板。再接种待测菌株，然后是结果判读

实验步骤

实验材料

普通营养琼脂培养基：可去生化试剂店购买，做不同细菌的药敏试验可选择不同的培养基，如做大肠杆菌的药敏试验可选择普通营养琼脂或麦糠凯培养基。做沙门氏菌可选择血清培养基。

药敏试纸：购买或自制（详见实验准备）

细菌：待做药敏试验的细菌

仪器：接种环、酒精灯、打孔器、牛津杯、移液器、滴头

实验准备

2.1　药敏片的准备：购买或自制

2.1.1　制备方法：取新华1号定性滤纸，用打孔机打成6毫米直径的圆形小纸片。取圆纸片50片放入清洁干燥的青霉素空瓶中，瓶口以单层牛皮纸包扎。经15磅15-20分钟高压消毒后，放在37℃温箱或烘箱中数天，使完全干燥。

2.1.2　抗菌药纸片制作：在上述含有50片纸片的青霉素瓶内加入药液0.25毫升，并翻动纸片，使各纸片充分浸透药液，翻动纸片时不能将纸片捣烂。同时在瓶口上记录药物名称，放37℃温箱内过夜，干燥后即密盖，如有条件可真空干燥。切勿受潮，置阴暗干燥处存放，有效期3-6个月。

2.2　药液的制备（用于商品药的试验）：按商品药的使用治疗量的比例配制药液；如商品药百病消按其说明量治疗量0.01%饮水，可按这个比例配制药液，可取10毫克加入10毫升的水中混匀。此稀释液即为用于做药敏试验的药液。

实验操作方法

3.1　药敏片法

3.1.1　在“超净台”中，用经（酒精灯）火焰灭菌的接种环挑取适量细菌培养物，以划线方式将细菌涂布到平皿培养基上。具体方式；用灭菌接种环取适量细菌分别在平皿边缘相对四点涂菌，以每点开始划线涂菌至平皿的1/2。然后，找到第二点划线至平皿的1/2，依次划线，直至细菌均匀密布于平皿。（另：可挑取待试细菌于少量生理盐水中制成细菌混悬液，用灭菌棉拭子将待检细菌混悬液涂布于平皿培养基表面。要求涂布均匀致密，直接悬液法要把菌液浓度用生理盐水或PBS调到0.5个麦氏标准再涂布均匀。）

3.1.2　将镊子于酒精灯火焰灭菌后略停，取药敏片贴到平皿培养基表面。为了使药敏片与培养基紧密相贴，可用镊子轻按几下药敏片。为了使能准确的观察结果，要求药敏片能有规律的分布于平皿培养基上；一般可在平皿中央贴一片，外周可等距离贴若干片（外周一般可贴七片），每种药敏片的名称要记住。

3.1.3　将平皿培养基置于37℃温箱中培养24小时后，观察效果。

3.2　牛津杯法

3.2.1　在“超净台”中，用经（酒精灯）火焰灭菌的接种环挑取适量细菌培养物，以划线方式将细菌涂布到平皿培养基上。具体方式；用灭菌接种环取适量细菌分别在平皿边缘相对四点涂菌，以每点开始划线涂菌至平皿的1/2。然后，找到第二点划线至平皿的1/2，依次划线，直至细菌均匀密布于平皿。（另：可挑取待试细菌于少量生理盐水中制成细菌混悬液，用灭菌棉拭子将待检细菌混悬液涂布于平皿培养基表面。要求涂布均匀致密。）

3.2.2　以无菌操作将灭菌的不锈钢小管（内径6mm、外径8mm、高10mm的圆形小管，管的两端要光滑，也可用玻璃管、瓷管），放置在培养基上，轻轻加压，使其与培养基接触无空隙，并在小管处标记各种药物名称。每个平板可放4-6支小管。待几分钟后，分别向各小管中滴加一定数量的各种药液，勿使其外溢。置37℃培养8-18小时，观察结果。

3.2.3　将平皿培养基置于37℃温箱中培养24小时后，观察效果。

3.3　打孔法：

该法较简单，成本低，易操作，比较适用于商品药物的检测。

3.3.1　在“超净台”中，用经（酒精灯）火焰灭菌的接种环挑取适量细菌培养物，以划线方式将细菌涂布到平皿培养基上。具体方式；用灭菌接种环取适量细菌分别在平皿边缘相对四点涂菌，以每点开始划线涂菌至平皿的1/2。然后，找到第二点划线至平皿的1/2，依次划线，直至细菌均匀密布于平皿。（另：可挑取待试细菌于少量生理盐水中制成细菌混悬液，用灭菌棉拭子将待检细菌混悬液涂布于平皿培养基表面。要求涂布均匀致密。）

3.3.2　以无菌操作将灭菌的不锈钢小管（外径为4毫米、孔径与孔距均为3毫米，管的两端要光滑，也可用玻璃管、瓷管），放置在培养基上打孔，将孔中的培养基用针头挑出，并以火焰封底，使培养基能充分的与平皿融合（以防药液渗漏，影响结果）。

3.3.3　加样：按不同药液加样，样品加至满而不溢为止。

3.3.4　将平皿培养基置于37℃温箱中培养24小时后，观察效果。

结果观察

在涂有细菌的琼脂平板上，抗菌药物在琼脂内向四周扩散，其浓度呈梯度递减，因此在纸片周围一定距离内的细菌生长受到抑制。过夜培养后形成一个抑菌圈，抑菌圈越大，说明该菌对此药敏感性越大，反之越小，若无抑菌圈，则说明该菌对此药具有耐药性。其直径大小与药物浓度、划线细菌浓度有直接关系。

判定标准

一、药敏实验的结果，应按抑菌圈直径大小作为判定敏感度高低的标准。

表1　药物敏感实验判定标准

具体对于不同的菌株，及不同的抗生素纸片需参照NCCLs的标准或者CLSI标准。

二、药物敏感实验判定标准参考表1，多黏菌素抑菌圈；在9毫米以上为高敏，6—9毫米为低敏，无抑菌圈为不敏。

影响因素

培养基

细菌药敏试验所用的培养基种类较多，多数情况下，采用WHO组织统一要求的M—H培养基，这种培养基中含有的低胸腺嘧啶是与磺胺类药物竞争的物质，因此进行的药敏试验效果较好。此外，还有适量的Ca、Mg，在培养基中起到触媒的作用。但是，有些细菌对培养基中的成分有特殊的要求，特殊的菌要用特殊的培养基才能进行药敏试验。例如，流感嗜血杆菌的药敏试验培养基用HTM琼脂；淋球菌的药敏试验培养基用加5%羊血的巧克力M—H琼脂；肺炎链球菌的药敏实验用M—H琼脂加5%的脱纤维羊血培养基。培养基中还有适量的Ca、Mg，在培养基中起到溶酶的作用，其含量的变化，可影响氨基糖苷类和四环素对铜绿假单胞菌的试验结果，含量过高，抑菌圈会变小，含量过低，抑菌圈会大得不可接受。

细菌药敏试验的培养基厚度大约为4mm，若培养基厚度大于4mm，会使细菌出现耐药；若小于4mm，本应耐药的易出现敏感。所以，试验时一定不要把药敏纸片放在中央部位，而应均匀地排布在平皿周围的培养基上。制作药敏试验的培养基用水，主要是Ca、Mg、A1等矿物质离子，也在很大程度上影响着药敏试验的结果。

试纸片

试纸片材质的好坏，对药物稳定性和活性有很大影响。加工药敏试纸片的试纸一般是使用加厚型的滤纸，杂质少，对药物保存无太大影响。然而，临床中很多用的是普通纸，被水浸润后会呈碱性，并且含有大量无机离子，因此使用普通纸加工的试纸片药物有较大的影响。药敏纸片的pH值一般要求为中性，这样才适合药的活度。药敏纸片的厚度要求大约1mm，这样才有利于细菌的生长和药物的扩散速度。药敏纸片的直径在6．00～6．35mm之间，纸片的厚度和直径大小都会影响药敏试验的结果。

含药纸片的片间差和质量好坏是做药敏试验的关键。一些药敏纸片买来时就有抑菌环偏大或偏小的问题，纸片之间又存在很大的片间差。因此，纸片在用前必须检验其片间差和准确度，只有都达到标准要求后才能使用。同时要注意纸片的保存，因为有的纸片，如青霉素类，在保存中因为受潮湿环境的影响容易降低其药物的活性。因此，纸片应放低温下(-10℃)保存，同时要避免潮湿，以保持抗菌药物的活性。盛纸片小瓶自低温处取出应在室温平衡至少10min后再打开，避免冷凝水影响药效。

细菌

由于各种菌对药物的敏感性不同，产生的抑菌环大小不同，如果菌种不纯，试验中所产生的抑菌环大小与该菌种在纯培养状态下产生的抑菌环大小存在较大的差异，影响判断结果的准确性。因此需要对各种致病菌提纯后，分别进行不同的药敏试验。药敏试验时，需要将提纯后的菌种配制成一定浓度的菌液。WHO组织制定的标准是要求菌液浓度在1．5亿/ml 左右。若菌液浓度过高，该菌会对所有药物产生耐药；反之，菌液浓度过低，该菌会对所有药物均敏感。最精确的方法是使用分光光度计测定新鲜培养物菌悬液的吸光度，来确定菌液浓度。国家细菌耐药性监测网的三级甲等医院，其微生物实验室大多数用此法来确定药敏试验的菌液浓度。

药敏试验中要将菌液均匀地涂在培养基上，使细菌均匀分布，这样才能使试验结果不会出现较大的偏差。涂菌后15min才能贴药敏纸片。由于涂菌后，细菌要有一段时间的适应过程，但是时间不能过长，否则会使细菌产生耐药。贴药敏纸片时，每取一种药敏纸片必须烧一下镊子口，避免药敏纸片之间相互混淆，以提高药敏的准确性。药物杀灭细菌存在一定的量比，药敏试验培养基上细菌层越厚抑菌圈就越小，反之抑菌圈就越大。根据一种药物抑菌圈的有无或者大小，只能判断出该药对细菌有没有效果，但其敏感性的高低需要通过科学严谨的实验来确定。药物的敏感程度需要根据药敏试验的结果，并结合以上因素做综合分析，才能得出科学的结论，而片面地根据药敏圈的大小来决定敏感与否，结果不够准确。

培养时间

一般培养温度和时间为37℃ 8-18小时，有些抗菌药扩散慢如多粘菌素，可将已放好抗菌药的平板培养基，先置4℃冰箱内2~4小时，使抗菌药预扩散，然后再放37℃温箱中培养，可以推迟细菌的生长，而得到较大的抑菌圈。

应用

药物敏感实验后，应选择高敏药物进行治疗，也可选用两种药物协助使用，以减少耐药菌株。在选择高敏药物时应考虑药物的吸收途径，因为我们药敏实验是药液直接和细菌接触，而在给禽用药的时候，必须通过机体的吸收才能使药物达到一定的效果，所以在给禽用药时，高敏药物一定要配合适宜的给药方法，这样才会达到好的治疗效果。

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