转座酶

执行转座功能的酶

执行转座功能的酶，通常由转座子编码，识别转座子两端的特异序列，能把转座子从相邻序列中脱离出来，再插入到新的DNA靶位点，无同源性要求。

TnsABC*

TnsABC*转座酶可用在GPSTM系列系统中（GPS-1基因组测序系统，GPS-M突变系统和GPS-LS蛋白质结构分析系统）将pGPS质粒中的Transprimer转座元件体外随机插入到任何期望的靶DNA内(1-3)。

来源

三个组成蛋白分别从含有编码TnsA、TnsB和TnsC*的质粒的E.coliK-12中纯化获得。

应用

用于GPS系统中所用到的Tn7源转座子的转位。

反应缓冲液

1×GPSBuffer25mMTris-HCl,2mMATP,2mMDTT(pH8.0@25°C)。补充15mM链转移反应起始溶液。37°C温育。

单位定义

在用0.08µg2.8kb对照质粒的标准对照反应体系中，能使至少1%的靶分子获得转座子插入所需要的酶量定义为一个单位。

热失活：75°C10分钟。

因子类型

插入序列

IS1是基因组中可移动的遗传因子家族中的成员之一，它可以整合到宿主非同源位点上，这就是转座(tronsposition)，若IS插入到某基因内，通常这个基因就会失活。这种精确的作用取决于IS有关的状况。例如IS2因子以同一方向插入到染色体中，则会减少基因的表达，但以相反方向整合，则会增加基因表达。相比之下IS1因子不论以什么方向插入都会降低基因的表达。

IS原来分为IS1~4，后面的数字反应它们被分离的先后次序和转座因子的总数无关。

正常的细菌染色体和质粒都含有IS。E.coli的标准品系似乎含有各种拷贝数（＜10）的IS因子。在原核生物中IS家族有很多成员，它们的结构相似，两端都有短的正向重复序列（directrepeats,DR）（靶序列），略长的反向重复序列（invertedrepeats,IR）以及1kb左右的编码区，它仅编码和转座有关的转座酶。对靶的选择有三种形式：随机选择，热点选择和特异位点的选择。

由于IS中有反向重复序列的存在，因此如果质粒上有IS，那么经变性和复性后，在电镜下可以观察到茎环结构的存在（图23-30）。

IS的转座是由转座酶（transposase）催化的，它由IS编码。首先转座酶交错切开宿主靶位点，然后IS插入，与宿主的单链末端相连接，余下的缺口由DNA聚合酶和连接酶加以填补，结果使插入的IS两端形成了DR或靶重复。

类插入序列

（IS-likeelements）是指IS10R，IR50R和IS903，它们的结构和IS相似，但不独立存在。而是作为复合转座子（compositetransposons）两臂的组件。

复合转座子

复合转座子要比IS长得多，中心区域编码抗性标记。不同的复合转座子的抗性标记不同。复合转座子两端的组件由IS和类IS组成。有的二侧组件相同（如Tn903），有的不同（如Tn10）。有的方向相同（如Tn9），有的方向相反（如Tn903，10，5）。有的皆有功能（如Tn903，10），有的仅右侧组件有功能。

据推测当两个独立的组件与中心区域连接时发展成复合转座子。这个结构可能由IS因子转座到紧靠供体位点的受体位点上。这两个组件可能相同或存在差异。单个组件转座整个复合转座子的能力解释了两个组件保持活性不受选择压力的影响。

在复合转座中是什么替代单个组件而担负起座的作用呢？特别是在两个组件都有功能的情况下。在Tn9例子中，它的组件是IS1因子，推测它们都有功能。为什么转座是整个复合转座，而不是IS的本身呢？

两个IS因子能使夹在其中的任何序列转座。如一个环状复制子上的Tn10它的两个组件IS10L和IS10R，也可以看成是复制子序列两端的组件，因此在进一步转座时它不仅可以使Tn10转座，也可心使复制子序列转座，但两侧面组件的序列与在Tn10中不同。

TnA家族

转座子（transposon,Tn）另一家族是TnA,长约5kb左右，两端具有IR，而不是IS，中部的编码区不仅编码抗性标记，还编码转座酶和解离酶。

TnA是复制转座的转座子。在此家族中Tn3和Tn1000（γδ）研究得最深入。通常末端有38bp左右的IR，在两个IR中任一个顺式作用缺失都会阻止转座。5bp的正向重复是靶位点产生的。它们都带有抗性标记（图23-33）。

TnpA介导转座分为两步,分别由tnpA,、tnpR编码的转座酶（transposase）和解离酶（resolvase）来完成的。这两个酶是通过实变鉴别出来的。此类转座和末端的IR有关。解离顺序（res）是内部的特殊位点，只有TnA家族才具有这一位点。

tnpA突变体是不能转座的，这个基因的产物是一种转座酶。它可以结合在末端38bpIR中的25bp的序列上。E.coliIHF的结合位点就在转座酶结合位点附近（在靶位点附近）。而转座酶结合和IHF的结合是协同性的。转座酶识别末端重复序列，并可以使靶DNA产生5bp的交错切割使转座子插入。IHF是一种DNA结合蛋，常在E.coli中组装成一个大分子，它在转座反应中并不起作用。

tnpR的产物具有双重功能，一是作为基因表达的阻遏物，另一个作用是具有解离酶的功能。tnpR突变将增加转座预率，这是由于TnpR阻遏了tnpA和它自己的基因转录，TnpR蛋白失活就使TnpA合成增多，结果增加了转座的频率。这表明TnpA转录酶的数量一定是转座的限制因子。

tnpA和tnpR基因之间有一个富含A-T的内部顺式控制区，TnpR的两种功能就是通过和此区的结合来实现的。

体外转座系统

系统加

该系统包含包括侧接一对细菌转座子Tn5外末端重复序列的可转座元件的DNA供体分子、可转座元件能够转座到其中的DNA靶分子以及一种经修饰的Tn5转座酶，该转座酶与外末端重复序列结合的亲合力高于野生型Tn5转座酶，呈失活多聚体形式的可能性低于野生型Tn5转座酶。

系统功能

一种对可转座DNA序列进行体外转座的系统

该系统包含：相对于野生型Tn5转座酶进行过修饰的Tn5转座酶，该经修饰的转座酶包含：一个相对于野生型Tn5转座酶的变化，该变化使经修饰的转座酶与Tn5外末端重复序列结合的亲合力高于野生型Tn5转座酶；另一个相对于野生型Tn5转座酶的变化是，该变化使经修饰的转座酶呈失活多聚体形式的可能性低于野生型转座酶；DNA供体分子，该分子包含可转座的DNA序列，DNA序列的5′和3′端侧接了Tn5外末端重复序列；和可转座元件能转座到其中的DNA靶分子。

设计动物

一种蝇类DNA的环状片段可能会使进行了遗传修饰的动物迅速增加，如同涓涓溪流变成滔天洪水一样。旧金山的Tosk生物技术公司声称它可以借助能跳入和跳出染色体的果蝇DNA以前所未有的效率将基因添加到哺乳动物细胞中。该公司的声明受到了其他生物学家们夹杂着热诚与怀疑的复杂成分的欢迎，他们警告说它的结果尚未被完全确定。来自纽约斯托尼布鲁克大学的TomRosenquist说：“如果它的结果如同他们所声称的那样，它将是革命性的。”将外源基因导入哺乳动物体内的技术仅停留在实验室阶段并且代价昂贵，因此该项技术仅用于研究和制造能产生高价值医药产品的动物。但是，如果制造GM动物（遗传修饰动物）变得便宜而且容易了的话，各个公司很快就可以对每种动物都进行修饰，包括从提供我们食物的农场动物到我们的宠物。Tosk的方法甚至可以用来改正人们的遗传缺陷。现在，GM哺乳动物通常采用在卵细胞中直接插入裸露DNA的方法。但是其成功率十分低：为了得到一个GM动物，一个熟练的技术人员也不得不进行若干次插入试验，然后将其中成功的胚胎移植培养。而另一种方法是从普通细胞开始，然后尽力去克隆整合了外源DNA的少数细胞。但是该方法的效率也不高。据《新科学家》杂志报道，Tosk的方法排除了上述繁杂的操作，外源DNA被简单地插入动物的血液中。据Tosk首席执行官PatrickFogarty声称，外源DNA将在两周之内以一个高比例整合到许多不同组织的细胞之中。由于一些精细胞和卵细胞也被改变了，通过正常的繁殖就能产生出每个细胞都携带外源基因的动物。Fogarty声称当小鼠通过尾部插入DNA而被修饰后，在其后代中约有平均40%的小鼠携带外源DNA——这是一个令人震惊的高比例。Tosk的秘密就在于使用跳动基因或转座子，它们已经在很多生物体中被发现。它们是遗传的寄生元件：没有功能的DNA环状片段，其仅有的独特能力就是在一种名叫转座酶的“剪切和粘贴”酶的帮助下通过跳入和跳出DNA来向四处传播。典型的转座子由编码转座子酶的基因所组成，其两侧带有独特的标记序列。当转座酶产生后，它以标记序列为目标导向将整个转座子剪切下来，并将它粘贴到细胞基因组别的位置上。最具活性的转座子之一就是在果蝇中发现的P－元件。数十年来，科学家们已经利用该转座子，通过将他们想转移的基因与转座酶基因相替换而制造出了转基因蝇类。但是没有人能在哺乳动物中很好地利用它。

现在，从斯坦福大学来到Tosk的Fogary说，通过对P－元件结构的调整，他的研究人员可以将该元件整合到超过80%的培养的人和鼠细胞中。这一基因运送系统由两组DNA环状片段构成：一个包含了待导入基因，其两侧带有标记序列；另一个则包含了P－元件转座酶基因。大量的上述DNA环状片段对被包裹在能帮助它们进入细胞的脂肪球中，然后插入一个动物体内。随后，该动物的细胞开始产生转座酶，转座酶将外源基因剪切下来并将其粘贴到细胞基因组的随机位点上。

转座酶基因本身不会被整合到细胞DNA上，而是在两周后分解掉。一旦转座酶分解掉，插入的DNA环状片段就固定下来了。

Tosk刚开始对外开展了一项服务即制造转基因动物，而且已有几位科学家开始订购了。来自伦敦帝国大学的生物学家LaurenceBugeon刚从Tosk得到了一批小鼠，他说：“如果它是真的话，它将是神奇的。”Fogarty说他们也开始与若干公司进行合作，在山羊、牛和猪中检测这项技术。然而，该公司的有关实验细节还没有公开发表，其声明被完全确认可能还要花上几个月时间。其他的科学家认为该公司需要做更多的实验来证明通过转座子进行的基因整合确确实实发生了。

Tosk并不仅仅研究开发转座子在基因运送方面的用途，已发表的著作中提到的对其他转座子的应用说明该技术也许可以成为改正人们遗传缺陷的有价值的工具。

基因疗法研究的主要方法是将裸露DNA注入细胞或利用病毒将DNA加到基因组上。但是，裸露DNA只能在短时间内起作用，而利用病毒则存在着明显的安全问题。转座子在这两方面都有着无与伦比的优势：稳定的整合而没有病毒的危险。一个从鱼身上提取的名叫“睡美人”的转座子已经成功地用于与嗜血杆菌一起将基因运送到小鼠肺中。但是即使是在培养物中，“睡美人”的整合率也很低——仅仅5%－6%的细胞。Tosk声称它的转座子的效率比“睡美人”高10倍，这真是一种巨大的差异。当然，需要确定的主要问题是转座子能否成为基因疗法的工具。哈佛医学院的RichardMulligan说：“但是如果你看一看遗传法则，就会知道它是一个神奇的系统，时间会证明这一切。”

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