DNA测序方法

分析特定DNA片段的碱基序列

DNA测序（DNA sequencing，或译DNA定序）是指分析特定DNA片段的碱基序列，也就是腺嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）、胞嘧啶（C）与鸟嘌呤的（G）排列方式。

名词解释

DNA测序（DNA sequencing，或译DNA定序），是RNA测序则通常将RNA提取后，反转录为DNA后使用DNA测序的方法进行测序。应用最广泛的是由Frederick Sanger发明的Sanger双脱氧链终止法，DNA sequencing technology，在分子生物学研究中，DNA的序列分析是进一步研究和改造目的基因的基础。用于测序的技术主要有Sanger等（1977）发明的双脱氧链末端终止法和Maxam和 Gilbert（1977）发明的化学降解法。这二种方法在原理上差异很大，但都是根据核苷酸在某一固定的点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，产生 A，T，C，G四组不同长度的一系列核苷酸，然后在尿素变性的PAGE胶上电泳进行检测，从而获得DNA序列。

发展历史

70年代末，WalterGilbert发明化学法、FrederickSanger发明双脱氧终止法手动测序，同位素标记

80年代中期，出现自动测序仪（应用双脱氧终止法原理）、荧光代替同位素，计算机图象识别

90年代中期，测序仪重大改进、集束化的毛细管电泳代替凝胶电泳

2001年完成人类基因组框架图

测序方法

第1 代测序技术

荧光标记的Sanger 法—— 在分子生物学研究中，DNA的序列分析是进一步研究和改造目的基因的基础。用于测序的技术主要有Sanger（1977）发明的双脱氧核糖核酸链末端终止法，Sanger测序法得到了广泛的应用。Sanger法是根据核苷酸在某一固定的点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，并且在每个碱基后面进行荧光标记，产生以A、T、C、G结束的四组不同长度的一系列核苷酸，然后在尿素变性的PAGE胶上电泳进行检测，从而获得可见的DNA碱基序列。 Sanger法测序的原理就是，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)使之扩增，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)使之终止。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3‘-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止，终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几个至千以上个，相差一个碱基一系列片断。它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用X-光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。

第2 代测序技术

循环阵列合成测序法—— 述第2 代测序技术中, 序列都是在荧光或者化学发光物质的协助下, 通过读取DNA 聚合酶或DNA 连接酶将碱基连接到DNA 链上过程中释放出的光学信号而间接确定的. 除了需要昂贵的光学监测系统, 还要记录、存储并分析大量的光学图像.这都使仪器的复杂性和成本增加. 依赖生物化学反应读取碱基序列更增加了试剂、耗材的使用, 在测序成本中比例相当大. 直接读取序列信息, 不使用化学试剂, 对于进一步降低测序成本是非常可取的.在一个正在发生突破瓶颈巨变的领域内, 很难准确预测未来将发生什么.

第3 代测序技术

直接测序——将基因组DNA 随机切割成大约100 kb 左右的片段,制成单链并与六寡聚核苷酸探针杂交. 然后驱动结合了探针的基因组文库片段通过可寻址的纳米孔阵列. 通过每个孔的离子电流均可独立测量. 追踪电流的变化确定探针杂交在每个基因组片段上的精确位置. 利用基因组片段上杂交探针的重叠区域将基因组片段文库排列起来, 建立一组完整的基因组探针

应用

DNA测序技术已经在基因组研究中得到了广泛的应用，使基因表达的精确度达到数字化,揭示了染色质组蛋白的新功能。

全世界二百多位专家学者，在为期四天的会上将交流新近问世的DNA测序技术的最新进展，探讨基因组学和基因测序技术在生命科学研究和生物产业中的更广泛应用。

最新研究发现，人类基因组中的大部分DNA都被转录成RNA并大范围地相互重叠，使人类基因组形成一个交织的网络。在这个网络里几乎没有没被使用的DNA序列，基因只是众多的具有功能意义的DNA因子的一种。这些基因组新特性的发现将有力地促进精确、廉价和高通量的基因组技术的研究和开发以加深对基因组结构和功能的探索，使基因组学的研究成果广泛地应用于临床医学和卫生保健。新的DNA测序技术同时还是表观基因组学、比较基因组学，环境基因组学和癌症基因组等计划的主要推动力。

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