原位PCR

在组织细胞里进行PCR反应

原位PCR是Hasse等于1990年建立的技术，就是在组织细胞里进行PCR反应，它结合了具有细胞定位能力的原位杂交和高度特异敏感的PCR技术的优点，是细胞学科研与临床诊断领域里的一项有较大潜力的新技术。原位PCR既能分辨鉴定带有靶序列的细胞，又能标出靶序列在细胞内的位置，于分子和细胞水平上研究疾病的发病机理和临床过程及病理的转归有重大的实用价值。

组织处理要求

处理后的标本，既要保持组织，细胞的形态结构，并增加细胞膜通透性，又要充分暴露拟扩增的目的DNA或RNA，使引物、探针能有效进入胞浆中发生反应。

应用范围

主要应用于两方面：（1）检测外源性基因片段，提高检出率，集中在病毒感染的检查上，如HIV、HPV、HBV、CMV等；（2）观察病原体在体内分布规律（3）内源性基因片段，如人体的单基因病、重组基因、易位的染色体、Ig的mRNA片段、癌基因片段等。（4）检测导入基因；（5）遗传病基因检测如β－地中海贫血。

大致过程

实验用的标本是新鲜组织、石蜡包埋组织、脱落细胞、血细胞等。其基本方法为多聚甲醛固定组织或细胞，蛋白酶消化处理组织；在组织细胞片上滴加PCR反应液进行扩增，覆盖并加液体石蜡后，在原位PCR仪上进行PCR循环扩增，PCR扩增结束后用标记的探针进行原位杂交，最后显微镜观察结果。

实验玻片处理

清洁液清洗→自来水冲，烘干→强酸24h→自来水，蒸馏水洗，烘干95%乙醇数小时→烘干，高压消毒。再用多聚赖氨酸APES(3-氨丙基三乙氧硅烷)包被。

固定液的选择标准是什么？

保持组织结构，最大限度地保持细胞内DNA或RNA水平，使引物和探针更易于进入细胞内，在规定的时间内进行反应。

固定液固定时间

固定剂固定时间

细胞组织

甲醇/丙酮(1:2) 4min 20min

甲醇/丙酮(1:1) 4min 20min

4%多聚甲醛 30min 60min

2%戊二醛 30min 60min

10%中性福尔马林 overnight overnight

基本方法

① 固定组织或细胞：将组织细胞固定于预先用四氟乙烯包被的玻片上，并用多聚甲醛处理，再灭活除去细胞内源性过氧化物酶。

②蛋白酶K消化处理：用60ug/ml的蛋白酶K将固定好的组织细胞片55℃消化处理2h后，96℃2min以灭活蛋白酶K。

③PCR扩增：在组织细胞片上，加PCR反应液，覆盖并加液体石蜡后，直接放在扩增仪的金属板上，进行PCR循环扩增.有的基因扩增仪带有专门用于原位PCR的装置。

④杂交：PCR扩增结束后，用标记的寡核苷酸探针进行原位杂交。

⑤显微镜观察结果。

待检石蜡切片上的非特异性结合位点经过充分封闭，内源性DNA和RNA经核酶充分消化后，通过生物素化单抗与亲和素系统的桥联，将生物素化的DNA报告分子固定在石蜡切片上，进行原位PCR扩增，扩增产物经原位核酸杂交，以杂交信号指示待测抗原是否存在。

与PCR区别

PCR是提取细胞或组织中的DNA进行基因扩增反应，而原位PCR是保持细胞或组织的完整性，使PCR反应体系渗透到组织和细胞中，在细胞的靶DNA所在的位置上进行基因扩增，不但可以检测到靶DNA，而且还可以了解靶DNA存在于何种细胞中，更有利于探讨靶DNA与细胞之间的关系。

PCR所采用的反应体系能否应用于原位PCR

PCR与原位PCR所采用的反应体系中都包括Taq聚合酶缓冲液、Mg2+、K+、4×dNTP、一对特异性引物和Taq聚合酶。但是由于组织细胞间质会吸附Mg2+，所以原位PCR中采用的Mg2+浓度要比PCR的要高，采用4.5-5.5mM可以保证有足够的Mg2+进行反应。另外由于原位PCR中的基因扩增过程中，各反应成分须经过渗透到靶DNA处才能进行扩增，所以建议将反应循环数增加到35 个。

所需设备

原位PCR反应是在载玻片的平面上进行，保持水平可以使反应各组分均匀地分布在组织切片上，所以须在原位PCR仪上进行，该仪器不但可以使载玻片保持水平，而且还可以给载玻片进行均匀地加热，保证扩增反应的顺利进行。

探针种类

与原位杂交一样，检测原位PCR结果的探针可以是DNA探针，也可以是寡核苷酸探针，DNA探针的长度在100－200bp为宜，寡核苷酸探针为多个，在20－40bp为宜。

探针标记物种类

常用标记物有地高辛半抗原（digaoxigenin），生物素（biotin），过氧化物酶（HRP），还可以标记一些荧光物质如异硫氰酸荧光素（FITC），花青（cyanine，Cy2，Cy3，Cy5）等。

设定对照实验

设立阳性对照，即用已知阳性细胞或组织切片做阳性标志，实验结果应呈阳性，表明实验方法准确可靠。同时要设立阴性对照，即用已知阴性细胞或组织切片作阴性对照，实验结果应呈阴性，表示实验方法无假阳性结果；也可以用实验细胞或组织切片，不加标记的dUTP（直接法），PCR结果显示阴性，或不加引物或不加TaqDNA聚合酶等，结果均应阴性。

原位PCR中直接法和间接法有何异同

直接法：进行原位PCR扩增以前，把同位素或非同位素(常用)标记的核苷(如dig-dUTP及Biotin-dUTP)标记的底物或引物5’末端连接标记物加入PCR反应液中，随着扩增的进行，标记的核苷或引物直接掺入到PCR产物中，然后免疫组化直接进行检测。间接法：先进行细胞内目的DNA基因原位扩增，然后用标记的探针进行核酸分子原位杂交以定位检测扩增的DNA的技术，步骤相对较多，需时长，但结果可靠。

获得特异原位PCR结果需要考虑哪些关键因素

原位PCR技术操作包括了组织学技术、PCR技术、原位杂交技术及免疫组化学技术，因此在复杂的操作过程中，有很多因素影响实验结果。要考虑的一些关键因素有待检组织的有效固定，在PCR前的组织预处理包括酶消化使核酸有效暴露，PCR环节中要设计特异的扩增引物、Mg2+的浓度、TaqDNA聚合酶用量、反应循环参数。间接法中用原位杂交检测时考虑探针浓度、抗体浓度和显色时间。

原位PCR中的组织预处理和原位杂交是否相同

要获得理想的原位PCR结果，需要将待检组织进行预处理使核酸充分暴露，这和原位杂交组织预处理的原则相同。因此原位杂交中的组织预处理步骤如HCL和蛋白酶处理等同样适用于原位PCR。

优势和不足

PCR虽然能扩增包括福尔马林固定、石蜡包埋组织的各种标本的DNA，但扩增的DNA或RNA产物不能在组织细胞中定位，因而不能直接与特定的组织细胞特征相联系，这是该技术一个局限性。原位杂交虽具有良好的定位能力，但由于其敏感性问题，尤其是在石蜡切片中，尚不能检测出低含量的DNA或RNA序列。而原位PCR可使扩增的特定DNA片段在分离细胞和组织切片中定位，从而弥补了PCR和原位杂交的不足。

组织芯片和传统的病理切片进行原位PCR异同

两者实验所需试剂没有差别，但由于组织芯片的高通量特点，比起传统的病理切片来说，所加的试剂量要远远低于病理切片，劳动强度也大大降低。

配置

主机一台，个人存储卡一张，原位PCR适配器

1.适用于96×0.2ml PCR管或77×0.5ml PCR管或8×12PCR板不需要更换模块；

2.反应槽温控范围：4-99℃；

3.控温精度：±0.2℃；

4.模块均一性：≤±0.5℃；

5.温控速率：升3℃/秒,降2℃/秒，速率可调；

6.程序数目：仪器可存100个，配单独的个人卡，卡上可存10个，方便插入其他同类机器上直接调用预设好的程序；

7.设有断电自动重启选项

8. RS-232接口和打印机接口