基因表达谱

非偏性cDNA文库

基因表达谱(gene expression profile)：指构建处于某一特定状态下的细胞或组织的非偏性cDNA文库，通过大规模的cDNA测序，收集cDNA序列片段、定性、定量分析其mRNA群体组成，从而描绘该特定细胞或组织在特定状态下的基因表达种类和丰度信息，这样编制成的数据表就称为基因表达谱。

基因概述

基因表达谱的获得与表示

在基因芯片的实验中，首先选取来自不同状态的样本，如正常组织与肿瘤组织、不同发育阶段组织，或用药前后的细胞或组织等。其中一种被称为实验样本，另一种就是相应地被称为参考样本。实验样本和参考样本mRNA在逆转录过程中，分别用不同的红、绿荧光基团标记，并将它们混合，与微阵列上的探针序列进行杂交，经过适当的洗脱步骤后，用激光扫描仪对芯片进行扫描，获得对应于每种荧光的荧光强度图像，通过专用的图像分析软件，可获得微阵列上每个点的红、绿荧光强度（Cy5和Cy3），其比值（Cy5/Cy3）称为该基因在实验样本中的表达水平。

Step1：基因芯片的制备。在硅胶、玻璃片、聚丙烯或尼龙膜等载体上按特定的排列方式固定大量的探针，形成DNA芯片。芯片种类较多，制备方法也不尽相同，基本上可以分为两大类：原位合成和直接点样法。

Step2：荧光标记探针的制备。将待分析的基因探针在芯片杂交之前进行纯化、逆转录或扩增级荧光标记。最普遍的荧光标记法是用Cye3-dUTP(绿色荧光)标记对照样本，Cye5-dUTP(红色荧光)标记实验室样本。

Step3：标记探针与芯片杂交。选择杂交条件，将制备的荧光探针与芯片进行杂交，一定时间以后，洗去未结合探针，然后进行荧光信号的扫描与分析。

Step4：杂交芯片的扫描。杂交后的芯片用特定波长的激光进行激发，此时芯片上的探针会发出不同波长的荧光。用共聚焦激光扫描仪检测探针的荧光强度，可以得到Cy5和Cy3的两幅单色图像。分别对这两幅图像进行伪色彩处理，然后叠加称为一幅图像，这就是实验所得到的原始数据——杂交图像。图像中样点的荧光强度值间接给出了基因芯片中对应探针的相对丰度值。如果来自测试样本的表达丰度高，那么样点呈红色；如果来自参考细胞样本的表达丰度高，那么样点呈绿色；如果两者丰度相当，样点就呈黄色；如果二者没有进行杂交反应，则样点保持背景黑色不变。通过这种方法，取自两个不同样本的基因相对表达水平差异就可以表现出来。

Step5：将基因表达谱数据从杂交图像中提取出来，即将原始杂交图像转化为基因表达谱数据。

研究意义

肿瘤在组织形态学上被划分为多种不同的类型和亚型，而肿瘤亚型的准确诊断对肿瘤的临床治疗具有重要意义，然而肿瘤的分型在临床上一直处于难以处理的状态，许多形态学上相似的肿瘤，如白血病的许多亚型等都会有相似的临床症状，但却需要不同的治疗方法，从分子生物学的角度上看，肿瘤是由于某些染色体上DNA损伤致使细胞内基因异常表达，导致细胞生长失控、缺乏分化和异常增生的一类复杂基因疾病。正因为肿瘤发展机制的复杂性，100多年来的研究仍未揭开其中的奥秘。研究肿瘤基因表达谱、选取信息基因是从信息学角度出发以寻找肿瘤相关基因、发现肿瘤基因表达特征的直接手段。肿瘤基因表达谱数据显著特点是样本的位数高而样本很小、噪声冗余大而信息基因少。每个样本都记录了组织细胞中所有可测基因的表达水平，但实际上只有少数基因才真正同样本类别相关，它包含了样本分类的信息。信息基因选取问题是肿瘤基因表达谱分析的核心内容。它既是建立有效分类模型的关键，也是发现肿瘤分类与分型的基因标记物以及药物治疗潜在靶点的重要手段，人们对该问题已进行了一定程度的探索。然而，如何在基因表达谱的成千上万个基因中有效选出样本的分类特征，一直是肿瘤基因表达谱分析中的难点所在，这个问题仍有待深入研究。

当前的肿瘤分类技术高度依赖病理学工作者对肿瘤组织的主观判断，而基于微阵列技术，即使一些组织没有显著变化，利用基因表达谱也能够对之做出早期诊断；基于基因表达谱的肿瘤分型和分类研究为理解肿瘤的发生的机制，以及肿瘤的临床治疗提供了重要依据；研究人员可以根据基因表达谱的变化来区分形态学上相似的肿瘤，而肿瘤类型的精确诊断将有助于制定配套的最佳治疗方案。

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