浓缩胶

化学物

浓缩胶是在不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳中，同一介质的凝胶浓度分为两种，负极的加样侧一般浓度为2%〜5%，称为浓缩胶，其余部分浓度为6%〜8%，称为分离胶。由于浓缩胶浓度低、孔径大，而分离胶浓度高、孔径小。带电荷的蛋白质或核酸离子在大孔径胶中移动时阻力小，移动速度快，当接近小孔径的分离胶时，遇到的阻力大，移动速度减慢而使样品浓缩，形成一条狭窄区带，以减少电泳过程中的谱带扩散。浓缩胶与分离胶的pH值不同也可以强化样品的浓缩作用。（王保捷）

作用

浓缩胶的作用是有堆积作用，凝胶浓度较小，孔径较大，把较稀的样品加在浓缩胶上，经过大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的区带。当样品液和浓缩胶选pH6.8的TRIS/HCL 缓冲液，电极液选TRIS/甘氨酸。电泳开始后，HCL解离成氯离子，甘氨酸解离出少量的甘氨酸根离子。蛋白质带负电荷，因此一起向正极移动，其中氯离子最快，甘氨酸根离子最慢，蛋白居中。电泳开始时氯离子泳动率最大，超过蛋白，因此在后面形成低电导区，而电场强度与低电导区成反比，因而产生较高的电场强度，使蛋白和甘氨酸根离子迅速移动，形成以稳定的界面，使蛋白聚集在移动界面附近，浓缩成一中间层。大大提高了电泳的灵敏度。

配制方法

一般同工酶可选择7?5%～10%的胶(过氧化物酶和酯酶7?5%较合适，超氧化物歧化酶用10%，可溶性蛋白可根据需要配制)。将配制好的凝胶液置真空干燥器中，抽气10Min，再加入TEMED15μl；混匀后用一细玻棒引流，沿无凹槽的玻板缓缓注入胶室中，注胶过程要防止气泡产生。胶液加到离凹槽3CM处为止，立即用注射器轻轻在胶溶液上面铺1CM高的水层，但不要扰乱丙烯酰胺胶面。待分离胶和水层之间出现清晰的界面时，表示聚合已完成。用注射器小心吸出上层覆盖水，按表5－1配制好浓缩胶，抽气后加入5μlTEMED，混合后加到分离胶上层，插入预先选择好的样品梳，注意不要带入气泡。

配制表

类别分离胶浓缩胶

T%57.51012.51517.520330%Acr5.07.39.7512.3214.8817.420.011%Bis45.67.55.43.53.531分离胶缓冲液3.753.753.753.753.753.753.75-浓缩胶缓冲液-------2.5重蒸水17.0513.158.88.337.675.153.055.4310%AP0.20.20.20.20.20.20.20.07注：分离胶30Ml，浓缩胶10Ml，可根据需要，按比例增减各成分的体积。

操作过程

.样品制备采小麦幼苗上数第一展开叶，取中部，除去叶脉，准确称取1g，加入少量提样缓冲液，置冰浴研磨匀浆后定容至5Ml，10000r/Min离心15Min，上清液为可溶性蛋白质的粗提液。取此液0?5Ml加入等体积样品处理液，混匀后贮于冰箱备用。

(1)将制好的凝胶板夹在电泳槽上，向上下槽注入电极缓冲液，取下样品梳(注意不要拉断样槽隔墙)。将微量进样器针头插入样槽下部慢慢进样，每槽点样15～20μl。

(2)上槽接负极，下槽接正极，接通电源，电流调至15～20MA，电压为200V，电泳至溴酚蓝标志到达凝胶前沿为止，将电流、电压调至零后断电。

(3)电泳结束后，取下玻板，揭掉胶布，抽出夹条，将两块玻板置自来水龙头下，借助水流，用解剖刀柄轻轻从板侧缝间撬开玻板(注意切忌从凹槽处撬)，将胶放入染色液中。

(1)过氧化物酶染色称取0?1g联苯胺，加少量无水乙醇溶解，依次加入5Mol/LHAC10Ml，1?5Mol/LNAAC10Ml，H2O70Ml，最后加入3～5滴H2O2。将此显色液倾入20CM培养皿中，待电泳凝胶片加入后不断搅动，观察各条带显色的先后，照相或用铅笔画出过氧化物酶同工酶谱。最后用7%醋酸固定(注意色带在HAC溶液中容易退色，固定时间不宜过长)，拍照或制成干胶片保存结果。

(2)酯酶同工酶显色　称取50Mgα－醋酸萘酯，50Mgβ－醋酸萘酯，100Mg坚牢蓝RR(或坚牢蓝B)，先用约5Ml丙酮溶解，再用0?1Mol/LPH5?0的磷酸缓冲液稀释到150Ml，将胶板浸入100Ml此液中，室温下显色约20Min，可看到桃红色的磷酸酯酶同工酶区带。弃去染色液，用蒸馏水漂洗，再用7%HAC固定。

（3）超氧化物歧化酶染色　染色液组成：氮蓝四唑(NBT)25μMol/L；核黄素0?01%；50MMol/LPH7?8磷酸缓冲液(含1MMol/LEDTA)。染色时，将准备好的电泳胶板放入盛有80MlNBT溶液(根据胶板大小加减溶液用量)的培养皿中，浸泡15Min后，换核黄素溶液浸泡5Min；然后将胶板放入含有1MMol/LEDTA的PH7?8磷酸缓冲液中，在距胶板10CM高度用40W日光灯直射胶面，直至蓝色背景上出现透明条带为止。

(4)过氧化氢酶同工酶染色　染色液的组成：A液为3%H2O225Ml，0?1Mol/LPH7?0磷酸缓冲液5Ml，0?1Mol/LNA2S2O33?5Ml；B液为0?09Mol/LKI25Ml加蒸馏水25Ml。先将准备好的电泳胶板浸泡在A液中，室温下放置15Min，倒出A液，用蒸馏水彻底冲洗干净，加入B液，酶活性表现在蓝色背景上的白色区带。蒸馏水漂洗后用10%甘油固定。

(5)可溶性蛋白的染色称取0?2g考马斯亮蓝R250，用少量无水乙醇溶解，用含有40%乙醇和7%醋酸的水溶液稀释至200Ml。将胶板浸入此液室温下染色5～6H，倒去染色液，用水冲洗附着于胶面的染料，再将胶浸入脱色液中(400Ml乙醇，70Ml冰醋酸加水到1000Ml)更换脱色液几次，直到背景清晰为止。

(6)结果保存将脱过色的凝胶照相或扫描后作为实验报告的凭证。作为学生实验报告可用绘图或制作干胶的方法记录酶谱带或可溶性蛋白质的主要谱带或用干胶片保存结果。方法如下：

干胶制备：裁下2张比胶片四边长3CM左右的玻璃纸在水中浸湿后，先将一张平铺在玻璃板上，放上凝胶片，再盖上另一张，用玻棒赶走气泡，将玻璃纸边缘折向玻板底部，用另一块同样大小的玻璃板压住，再用夹子夹住两端固定，室温下避光放置1天左右即可，然后取下干胶，修剪整齐保存。

绘图表示：将各酶带按颜色深浅绘成谱带图。

附注

1.SOD同工酶电泳时，分离胶浓度应选择10%，样品提取液用50MMol/LPH7?8的磷酸缓冲液比较理想。

2.ACr和BIs是神经性毒剂，且对皮肤有刺激作用。配制贮液、配胶、灌胶操作时，要戴上医用乳胶手套或指套，避免与皮肤接触。只要细心操作，一般不会引起损伤。

3?ACr和BIs的纯化。精确的定量分析和制备电泳需要纯度更高的ACr和BIs，其提纯方法如下：

(1)ACr重结晶方法　将ACr溶于50℃氯仿中(70g/L)，趁热过滤，滤液冷却至－20℃，结晶。用冷的布氏漏斗抽滤，收集结晶?用冷氯仿淋洗结晶，真空干燥。纯ACr的熔点为84?5±0?3℃。

(2)BIs重结晶方法　将12gBIs溶于1000Ml40～50℃的丙酮中，趁热过滤，滤液逐渐冷却至20℃，用冷的布氏漏斗抽滤，收集结晶。用冷丙酮淋洗，真空干燥。纯BIs的熔点为185℃。

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